目录：1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1)2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2)3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,44.免疫组织化学染色结果评价 (4)5.免疫组织化学对照实验 (5)6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,67.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,78.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,89.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,910.非特异性荧光染色的消除 (9)11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,1012.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,1213.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11)14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12)15.双重免疫荧光标记法 (13)16.免疫荧光组织化学直接法 (13)17.免疫荧光组织化学间接法 (14)1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。

此外还有一些新型荧光染料，如量子点。

(1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。

它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。

缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。

最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。

(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。

最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。

(3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。

最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。

(4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。

这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。

常用于多重染色。

Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。

但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。

Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。

由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。

通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。

(5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。

其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。

最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。

(6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。

无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。

最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。

(7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。

量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。

当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。

量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。

2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色免疫荧光组织化学(immunofluorescence histochemistry)或免疫荧光细胞化学(immunofluorescence cytochemistry)是将荧光作为标记物的免疫组织化学技术。

1942年，Coons等首次报道用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，从此开创了免疫荧光组织化学技术的先河。

随着荧光标记技术和单克隆抗体技术的不断发展和激光扫描共聚焦显微镜的应用，使免疫荧光组织化学的特异性、快速性和在细胞、分子水平定位的敏感性与准确性大大提高。

它能将生物样品形态、功能和代谢密切结合，在细胞、亚细胞水平原位检测抗原分子，这是其他任何生物技术难以取而代之的。

故目前免疫荧光组织化学技术已成为生物学、基础医学和临床医学各学科领域常用研究方法之一。

免疫荧光组织化学技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。

根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体(或抗原)标记荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原(或抗体)反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光照射而发出各种颜色荧光，利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原或抗体进行定性、定位乃至定量研究。

蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光组织化学技术检出。

若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片，可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再进行免疫荧光或其他免疫细胞化学染色。

3.免疫荧光组织化学技术的荧光荧光(fluorescence)是某些物质被一定波长的光(如紫外光)照射后能发射出一种比激发光更长的光。

光的吸收具有高度选择性，即一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物贡分子或原子所吸收，如石英玻璃几乎不吸收可见光，但有较强的吸收红外光作用。

利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片(如荧光显微镜中的激发滤片和阻断滤片)，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颈色的荧光。

茧光产生示意圈荧先显微镜中常用光的波长与颜色的关系4.免疫组织化学染色结果评价对免疫组织化学染色所得结果的判断要持科学态度，根据对照实验准确判断阳性和阴性结果，排除假阳性和假阴性结果。

为使实验结果准确无误，应多次重复进行实验。

最后得出科学的结论。

为达此目的，首先应学会区别特异性和非特异性染色结果。

非特异性染色的特点是：细胞和间质染色无区别或间质染色更强；染色无特定部位，无结构性；染色五分布规律，某一部位均匀着色；染色出现在切片的干燥部位、边缘、刀痕或组织折叠处。

排除非特异性染色之后，应确定特异性染色在组织细胞中的部位和程度，并且考虑是否有必要进行半定量测定。

《一》以抗原表达模式定位1．细胞质内弥散性分布，多数免疫组织化学染色为胞质型阳性反应，如细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和波形蛋白(Vimentin)等。

免疫组织化学染色(SP法。

AEC显色)胚胎12天人员端脑背侧脑室区司见波形蛋L(Vimentin)免疫反应阳性细胞：其胞体位于脑室区。

一端伸出长突起到达软脑膜2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色。

3．胞浆内局限性点状阳性反应，如CDI$抗体的染色。

4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此，如CD20。

5．细胞核阳性反应，如BrdU、Ki-67及雌、孕激素受体蛋白等。

有些抗原的阳性表达可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。

《二》阳性染色结果定量1．计算免疫反应阳性细胞数方法是选择每个样品中10个非重叠视野，计算每个视野中的阳性细胞与总细胞数的百分比，取平均数，连续观察和计算至少二个条件相同的样品。

得出数据经统计学处理后可在计算机Microsoft Excel中作出柱形图。

2．另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0～25为阴性，25～50为+，50～75为++，75以上为+++。

此种判定方法容易出现人为误差，现已很少在论文中出现。

3．图像分析系统检测阳性结果。

5.免疫组织化学对照实验由于影响免疫组织化学染色结果的因素甚多，染色中必须有对照实验，否则不可能正确评价染色结果。

对照实验包括阴性对照、阳性对照和自身对照。

在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照．而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自身对照具有节约的意义。

观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞具有可信性。

免疫组织化学染色中对照片的设置非常重要．它是判断染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准。

常设的对照实验如下。

对照实验方法和结果分析6.免疫组织化学技术应用的基本原则免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。

并且涉及许多研究领域。

但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充分考虑这些特点。

如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位杂交技术解决。

为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，将其应用的基本原则简述如下：1．确定细胞类型和形态组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维酸性蛋白(gial fibrillary acidic protein，GFAP)只存在于星形胶质细胞内．神经丝蛋白(Neurofilament，NF)只存在于神经细胞内。

通常把这些具有组织特异性的蛋白称为标记性蛋白(Proteiniliaker)。