免疫组织化学染色（IHC）
定义：
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本
1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；
2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤
①石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h
3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45 min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5 h或侵蜡过夜，用石蜡（Ⅲ）包埋组织。
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 μm厚度的组织切片。
6、贴片：将组织石蜡切片放在在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2-4 h
②免疫组织化学染色（SP三步法）
1、脱蜡
取出烘烤后保存的石蜡切片，室温放置30 min，然后分别在二甲苯I、II、III中浸泡各10 min。
2、复水
无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各5 min→95%乙醇溶液5 min→80%乙醇溶液5 min→70%乙醇溶液5 min→50%乙醇溶液5 min→ddH2O 5 min。
3、PBS冲洗2-3次，每次5min
4、灭活
3% H2O2溶液孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性
5、PBS冲洗2-3次，每次5min
6、抗原修复
将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温
7、PBS冲洗2-3次，每次5min
8、封闭
滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体；
9、滴加Ⅰ抗50 μl，室温静置1 h，或者37℃ 1 h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）；
10、PBS冲洗2-3次，每次5min；
11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50 μl，室温静置1 h，或371
℃ h；
12、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30 min-1h；
14、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
15、显色：DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）
（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）
（A：DAB B：H2O2C：磷酸缓冲液）
16、自来水冲洗10分钟终止反应
17、复染：苏木精复染2 min，盐酸酒精分化
18、自来水冲洗10-15min
19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
③结果分析
每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
免疫组化常用试剂及设备：
1、PBS：0.01 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)
2、固定液：4% 多聚甲醛溶液 (pH 7.4)
3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%
4、二甲苯
5、包埋剂：石蜡
6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）
7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）
8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）
试剂A --阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30% H2O2和80%甲醇溶液配制）
试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清
试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）
试剂D --SP（链霉亲和素-过氧化物酶）
9、一抗（特异结合底物）
10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液
11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等
12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统
常用固定液
1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
（1）3%中性甲醛固定液液：30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
（2）4%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml，加热搅拌（注意不要沸腾）至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml
（3）戊二醛－多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1％的戊二醛
（4）Bouin液：40％甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.
（5）PLP液(过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液)
2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀
（1）AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml
（2）Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定
（3）Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存
（4）丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在4℃冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min
3、其他固定剂
（1）Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测
（2）四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液
抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因：
a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；
b. 甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复
（1）高压热修复：
在沸水中加入0.5 mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）或0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：
电炉或者水浴锅加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波热修复：
在微波炉里加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
②酶消化法：
常用0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、皂素（Saponin）。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。