第八节真核生物的DNA复制在上一节中,已经从解决线形DNA复制终止问题的角度讲解了一种真核生物病毒一一腺病毒的DNA复制。

本节将要讲解真核生物的复制原点,复制元和复制元族;真核生物的DNA聚合酶和引发酶;作为真核生物DNA复制模型的SV40的复制原点和大T抗原以及复制过程;真核生物染色体末端的DNA的复制F真核生物复制过程中的核小体结构。

一、真核生物的复制原点,复制元和复制元族在E.coli中,DNA复制速度大约是105bp/分,而真核细胞的DNA聚合酶活性要低得多,复制速度大约为500bp/分~500Obp/分。

这样,如果按典型的哺乳动物染色体DNA(比E.coliDNA大50倍)来计算,则真核DNA的复制时间就会是E.Coli的1000倍即约一个月的时间。

事实上,真核生物DNA复制时间一般为几个小时。

这是通过从许多复制原点同时开始并双向复制而实现的。

用放射自显影方法在哺乳动物染色体上看到许多复制泡,每个复制泡都有固定的起点(复制原点),然后双向伸展,与相邻的复制泡会合。

这样一段段的DNA就称为复制单元,简称复制元（replion)。

复制元的大小是不均一的,从1.3万bp~90万bp不等。

不同生物的复制元大小当然不会相同；就是同一种生物在不同的生长条件下,复制元的大小也不同。

生长快的时候,复制元就小。

例如果蝇大约有5000个复制原点,每个复制元平均大小约3万bpz而在卵受精后,复制起点增加到大约5万个,仅需3分钟就可以将整个基因组复制完毕。

其调节机制目前毫无所知。

几个邻近的复制元可组成复制元族,每个复制元族少至两个复制元,多至250个复制元。

不同的复制元族在复制起始的时间上有先有后,而同一复制元族内各复制元基本上是同步的。

真核生物的复制原点的DNA序列并无固定的模式,但大多包含一个富含AT的序列,可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。

二、真核生物的DNA聚合酶和引发酶与真核细胞中多起点复制相应的特点是细胞中DNA的聚合酶分子数目多。

在E.Coli中,只有pol Ⅲ10个~20个分子,而一个典型的动物细胞含有DNA聚合酶α2000个~60000个分子。

DNA聚合酶α可能是真核生物的主要的DNA聚合酶,此外还有DNA聚合酶α和β。

现将四种DNA聚合酶的性质总结于下表。

大多数真核生物DNA聚合酶都只有聚合活性,而不像细菌DNA聚合酶那样除了聚合活性外还有外切酶活性。

而新近发现的DNA聚合酶β不但有聚合酶活性,而且还有3'→5'外切酶活性。

DNA聚合酶α与DNA引发酶结合得相当紧密,甚至在用DNA聚合酶α的抗体进行亲和层析时,这个紧密的复合物也一同被吸附;但DNA引发酶可以被50%乙二醇(ethylene glycol)所洗脱。

因此前几年人们认为DNA聚合酶α兼具引发酶的活性是不恰当的。

实验表明,DNA聚合酶α和DNA引发酶的复合物是复制体系所必需的。

DNA聚合酶α和δ在体外都可以被一种霉菌的抗菌素aphidicolin所抑制,在体内该抗菌素则抑制细胞DNA的复制。

实验表明,在细胞DNA合成期(S期),DNA聚合酶α的含量急剧增加。

而对于DNA聚合酶δ,控制细胞周期的蛋白质cyclin则是它不可缺少的辅助成分(亚基?)。

据此,人们推测,真核生物的DNA复制是由DNA聚合酶α和δ协同进行的。

DNA聚合酶。

在细胞周期中含量变化不大,可能与损伤DNA的修复有关。

DNA聚合酶γ的功能主要是负责线粒体DNA的复制，而它在核内的功能还不清楚。

四种DNA聚合酶的性质前面,我们介绍了真核生物的DNA聚合酶。

现在,我们还必须了解真核生物DNA引发酶的性质。

引发酶分子量大约5OKDa-6OKD。

首先,正如上面所说,引发酶能够与DNA聚合酶α形成紧密的复合物。

这种复合物不但是复制所必需的,而且与结合于复制原点的特异性蛋白质构成了复制体.系的种族特异性。

例如,来自人类HeLa细胞的复制体系,如果用DNA聚合酶α抗体去除体系中的DNA聚合酶α和引发酶的复合物,则复制体系的其余组分不能支持SV40复制原点在体外的复制(在大T抗原存在时)。

如果加人人类HeLa细胞中的这种复合物或猴子COS细胞中的复合物,均能恢复复制能力。

而加入小鼠或牛的复合物以及E.coli DNA聚合酶I或聚合酶Ⅲ全酶均不能奏效。

这可能是该复合物与大T抗原之间的蛋白质-蛋白质的特异性作用有关。

其次,真核生物的DNA引发酶的引物合成方式较为特别。

它的作用是阵发式的,每次作用能拷贝6个-15个核苷酸。

当DNA聚合酶α缺少时,首次阵发性合成产物可以被下几次阵发性合成所延长成为很长的多聚核苷酸。

但是在有活性的DNA聚合酶α和足够的dNTP存在时,引物仅是第一次阵发性合成产物。

最后,DNA引发酶不但能利用rNTP为合成前体,而且还利用dNTP为合成前体。

在一次阵发性合成的引物中,第一个核苷酸总是rA；而以后的核苷酸要么都是核糖核苷酸,要么都是脱氧核糖核苷酸,而不能是二者都有。

由于引发酶能够合成少量的脱氧核糖核苷酸,因此精确确定DNA聚合酶α何时接替引发酶是很困难的。

然而,引物一般只有6个-15个核苷酸,对于SV40体外DNA复制情况的分析,发现它的引物仍然主要为6个-9个核苷酸的RNA。

三、真核生物染色体未端DNA的复制真核生物同样面临着线形DNA复制结束时所产生的5‵末端隐缩的问题。

这一问题的解决有赖于端粒的结构和能够识别或结合端粒的蛋白质和酶。

关于端粒蛋白质的研究正在进展之中,已发现的几种端粒蛋白质（见前述）。

Blackburn等人首先发现四膜虫端粒中存在一种端粒酶(telomerase),这种酶能够将四膜虫端粒结构中单链尾巴5'TTGGGG3'延长,延长的部分仍然是5'TTGGGG3'了。

事实上,各种端粒中这一富含G的序列总是突出12个－16个核昔酸。

后来又发现原生动物游仆虫〈euplotes〉和尖毛虫的端粒酶也能延长其富含G序列5'TTTTGGGG3'。

这种酶是一种核糖核蛋白,由RNA和蛋白质构成。

1990年,Blackburn等人又证明了端粒酶中的RNA是富含G序列的模板。

例如游仆虫的端粒酶RNA含有5'CAAAACCCCAAAACC3'这样的序列,对于拷贝出富含G序列所必需的部分为5'CAAAACCCCAAAA3'了。

这样,端粒酶实际上是一种逆转录酶,与还原病毒逆转录酶的差异只在于这个模板是在酶分子内。

端粒酶中的RNA可能还有别的作用。

这一富含G的单链尾巴的长度是如何控制的以及这一单链尾巴在复制中的功能都还不清楚。

这种单链尾巴可能弯转过来作为引物复制5'末端。

另一种可能性是某种端粒结合蛋白有可能像腺病毒pTP那样结合于最末端的单链重复序列,并作为蛋白质引物复制DNA的5'末端（右图）。

四、真核生物复制过程中的核小体结构真核生物细胞核的体积是很小的,而复制过程完全局限于核内进行,因此DNA必然是处于高度压缩状态下进行复制的。

而复制时必然涉及到核小体的转移与分配,因为DNA是半保留复制。

由于空间狭小,复制可能是分区进行的,这就是各复制元族不同步的原因。

现在人们已经用溴尿嘧啶脱氧核苷酸代替胸腺嘧啶核苷酸渗入到DNA,再用溴尿嘧啶脱氧核苷酸的抗体进行免疫杂交而证实了染色体的分区复制。

组蛋白八聚体是以全保守的方式传给子代分子的,这一结论的实验过程是：组蛋白的合成是在细胞核中与DNA复制同步进行的,因而细胞并不含有明显多余的组蛋白分子。

其精联的机制目前还不清楚。

这个事实对于我们证明组蛋白八聚体的解离与否却有很大的帮助。

老的八聚体是否解离以及如果解离又如何与新合成的组蛋白重组?将细胞置于轻培养基(12C,14N,l H)中生长很长时间。

然后将细胞转移到重培养基(14C, 15N,3H)中生长约1小时,分离组蛋白八聚体,在甲酸饱和的密度梯度中进行平衡离心。

如果是全保留装配的话,则得到一个高密度的放射性带p如果是随机的话,则得到一个高密度到低密度的弥散的放射性带;如果是半保留的话,则在中等密度处得一个单一的放射性带;结果表明,组蛋白八聚体的装配是全保守的。

这些老的八聚体和新的八聚体在两条子代DNA分子上是如何排列的呢?用上述密度梯度平衡离心的办法分析交联的相邻八聚体(16单体聚合物)同样可以证明半保留分布是正确的。

用蛋白质合成的抑制剂放线菌酮(cycloheximide〉可以得到同样的结论。

将这种抑制剂加到正在生长的细胞中,在此之前开始的一轮DNA复制将继续下去。

组蛋白是现用现造,在加人蛋白质合成的抑制剂后,就没有新生的组蛋白八聚体了。

这样在两个复制叉的两边,有一个分校的DNA是裸露的。

另一个分枝继承了亲代的组蛋白八聚体。

用电子显微镜可以看到这种现象。

这一结果表明,组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链。

最后的问题是,亲代的组蛋白八聚体到底与哪条链相结合? 迄今,人们只知道一种动物病毒SV40,它的老八聚体是与先导链相结合的(SV40也是有核小体结构的)。

如果一个复制单元从原点开始双向等速复制,则在子代分子的这一段序列上的组蛋白八聚体半截是老的,半截是新的(上图右)。