缺点：
× 精度差 × 脉动大 × 压力低
蠕动泵类型
单通道泵
多通道泵
柱塞往复泵特点

耐高压 脉冲小 流量宽、无极可调 重复性好、准确度高
柱塞泵工作原理
单向阀结构
宝石球
工作原理
吸液冲程
出口单向阀
排液冲程
抛光面
泵头 球座 流动相 进口单向阀
柱塞泵分类

按柱塞个数

单柱塞 双柱塞 三柱塞
1996年－2000年，北京化工大学，化学工程系生物化工专业，本科 2000年-2005年，北京化工大学，生命科学与技术学院，生物化工专业，博士，2006年至今，中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室
成果 发表论文26篇，其中，SCI收录论文21篇，申请专利9项，授权2项。 “多柱组合色谱高通量蛋白质分离设备及层析柱”获得2011中国仪器仪表协会科 技创新奖（第三获奖人）； “以保护活性为目标的生物技术药物层析分离纯化技术”获得2013中国分析测试 协会科学技术奖“CAIA奖”一等奖（第三获奖人）。
简单整合型
BioLogic LP (Bio Rad)
AKTA Prime (GE)
复杂整合型
AKTA Explorer (GE)
BioLogic LP (Bio Rad)
按规模分
实验室规模 AKTA pure 流速<150mL/min
中试规模 AKTA pilot 流速4-400mL/min
生产规模 AKTA process 流速0.75-30L/min
AKTA梯度性能考察
A：水 B：0.5-1.0%(v/v)丙酮
蛋白质的梯度洗脱注意事项

层析过程优化采取梯度洗脱或者阶越式洗脱方式； 反相层析探索条件时，梯度应尽可能长（>20个柱 体积）；

当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用 100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损 坏层析柱。
针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的 情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低 的基因工程蛋白质）；

料液前处理非常重要，进料前必须用0.45 μm或 更小孔径滤膜严格过滤； 进料过程必须密切注意压力变化； 推荐使用蠕动泵进料。

柱切换进料
解决下列问题

人工换柱带来的泄漏和污染 周期长导致蛋白质失活 通量低和收率低
在位清洗
根据样品的脏/干净的程度，可按软件中CIP程序定期清洗 系统，防止系统管道被堵，压力增高。11
维护——每半年
压力检测器
零点校正（pressure offset)。
紫外可见检测器
◇用注射器推10%的表面活性剂SDS注入紫外流动池
停留20分钟，用水冲洗。 ◇用用注射器推甲醇或1M NaOH注入紫外流动池，停留20分钟，用水冲洗。
4 进样系统

手动进样

直接倒入柱子顶部 进样阀进样

自动进样 泵进样 柱切换进样
进样阀

手动进样阀 自动进样阀

定子（Stator）
转子（Rotor）
AKTA进样阀操作
手动进样注意事项

进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒 吸 清洗：在Inject状态清洗进样口 对于Rheodyne进样器


目测法

色谱名称的由来 最古老原始的方法 在玻璃柱中观察带颜 色物质形成的条带
石油醚
色谱
色素 碳酸钙颗粒
组分
显色反应

没有在线检测器 针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等 设备要求低 工作量大
紫外-可见检测器

主要组成部分

光源 分光系统 样品池 光强探测器 固定波长检测器 可变波长检测器

实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保 存

使用完高盐溶液后用纯水冲洗
至少半个小时
定子（Stator）
转子（Rotor）
自动进样

进样动态范围广 样品残留少(连续洗针系统) 延迟体积少 进样重复性高(< 0.5% RSD) 主要应用于分析型色谱
泵进料



高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效 分离分析方法
层析分类
特性
层析分类
介质粒度 (μ m) 40 ~ 200 25 ~ 40 3 ~ 10
低压 中压 高压
操作压力 (MPa) 不明显高于 1atm 0.5 ~ 4 4 ~ 20
2. 蛋白层析系统的构造

输液系统：

(1)提供连续、稳定而精确的流量； (2)进行梯度洗脱；

因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测 隔一段时间运行一下多波长检测

6.维护——每天
系统
◇ ◇ ◇ ◇
清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备 溶液和样品必须过滤 检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。 使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。
pH计
◇ 使用前校正pH计。 ◇ 用后将pH计拆下放入保护液（1:1 pH 4 buffer和 2
主要内容

1.概述 2.蛋白层析系统的组成 3.输液系统 4.进样系统 5.检测系统 6.日常维护 7.选型购买
1 概述
液相色Leabharlann （层析）的发展古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素； 1903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文； 1960s, HPLC商用仪器出现

P-903 (10 ml/min) Low Flow LC Filter
缓冲液筛网
检查入口溶液的筛网是否很脏，如有必要须更换。
P-901(100ml/min) High Flow LC Filter
Polymer Support
泵冲洗系统
◇ 更换泵后冲洗液（20%乙醇）。 ◇ 如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密
3 输液系统
流动相输送方式

梯度混合方式

高位槽 气体压力 出口抽真空 泵送系统

梯度混合器 电磁阀（低压梯度） 高压梯度
蠕动泵 最常用 柱塞往复泵 其他类型的泵，如隔膜泵
最简单的方式
压力
高位槽
蠕动泵
真空
蠕动泵（软管泵）工作原理
优点：
结构简单，无密封件，无阀门 维护方便，易于清洗和清洁 可输送含颗粒液体以及高粘流体 很好的自吸功能，可干转 剪切力小，适合输送对剪切力敏感的 物料
M KNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。
Open
泵
◇检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵
头密封圈。
◇更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。
维护——每周
ON-LINE FILTER change
在线滤器
清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否 则会形成很高的在线压力，流速降低。


一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平 头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。 废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸
进样阀操作注意事项

进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造 成漏液和两个导流槽之间短路
pH/电导检测器
◇清洗流动池：拆下pH电极，用1M NaOH清洗pH和电导流动池
30分钟，用 水冲洗。 ◇清洗pH电极（响应慢或校正斜率小于80%时）： 1. 盐沉积：0.1M HCl/ 0.1M NaOH/ 0.1M HCl 交替洗数次，间隔5分钟。 2 . 油脂沉积：1%SDS清洗后水洗。 3. 蛋白沉积：1% 蛋白酶于0.1M HCl 溶液中清洗后水洗。
多柱组合层析
多柱组合层析纯化蛋白质实例
白蛋白、AT-Ⅲ、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度≥99%） α1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上 整个过程用时140分钟 采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天
5 检测系统
古老的方法：目测、离线显色反应

光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折 光、蒸发光散射、多角度激光散射等） 热学检测器（如吸附热等） 电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培 等） 电学检测器（如电导等）

Signal Dark A log10 reference Dark
纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作 出的曲线即为层析图谱

分类

单波长检测器 多波长检测器

二极管阵列检测器
固定波长紫外检测器
汞灯光谱图 滤光片原理示意图
固定波长紫外检测器
Pharmacia UV Monitor UV-1 AKTA PRIME和UPC所配检测器 汞灯为光源，荧光片和滤光片来选择波长，通常为 254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测 结构简单，价格较便宜 可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集 国产8823B
蛋白层析系统
李秀男 Email:xnli@ 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室
个人简介
研究方向
李秀男，博士，副研，硕导
生物分离工程：重点开展生化分离设备研制与产业化，生物技术药物分离分析新技 术、新方法的研究，蛋白质组合层析快速分离纯化平台，以及新型层析介质的应用 评价工作。 教育背景和工作经历
可变波长紫外-可见检测器
氘灯光谱图
氘钨双光源光谱图 钨灯光谱图
AKTA检测器
氙灯作为光源 优点：全波长、光强高 缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样