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原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
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原生质体融合
• 定义：指用自然或 指用自然或 人工方法、使两个 或更多个不同的细 胞融合成一个细胞 的过程，又称为体 细胞杂交
原生质体的制备 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成 不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此 要根据微生物种类特性选择合适的酶。
细菌细胞壁的结构 G+ 糖肽、底聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸、磷壁酸、脂多糖 G- 糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白 放线菌的细胞壁 二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 真菌的细胞壁成分 纤维素、几丁质、其它多糖
王玉华 John R P
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梁惠仪 朱惠
徐波 Hida H
先诱变再改组，获得耐高温 王灏 (35℃)及耐乙醇的菌株(提高5%， 12.93%vol) 酶活提高3.17倍 平均酶活高于原始菌株 产量最高为516.37ug/L，较亲本 提高了44.72% 仅一年时间获得高产菌株，传统 方法需20年 pH3.8下生长良好，产酸比野生 型提高3倍 对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓 度提高了10倍以上，并可降解 3mmol/L五氯苯酚 产羟基柠檬酸水平提高到145 mg/L 林俊 李立风 赵凯 Hiroyuki Patnaik Dai
哈 茨 木 霉 (Trichoderma 经 紫外 诱变得 到具有 MBC 得到同时具有MBC和戊唑醇 Lorant harzianum) 和 深 绿 木 霉 抗性及戊唑醇抗性菌株， 抗性的融合菌株 (T.atroviride) 进行融合 豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium 豌豆根瘤菌具有penr 抗性，融合菌株具有双亲抗性， 韦革宏 leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤 大豆根瘤菌具有cmr抗性 且能在双亲寄主植物上结 菌 (Sinorhizobium 瘤 xinjiangesis) 糖化酵母(S.diastaticus)和 单亲灭活 酿酒酵母(S.cerevisiae) 获得利用可溶性淀粉发酵 张华山 的融合菌株，利用率达 64.3%，在含5%淀粉发酵中 酒度可达6.5%(v/v) 产生能直接利用淀粉产乳 John R P 酸，产量40g/L，淀粉转化 率96%
白腐真菌(Phanerochaete)和 白腐真菌能有效降解木质 融合子可将木质素有109降 Zhang 白 地 霉 (Geotrichum 素，白地霉可生成单蛋白 到54g/kg，使得秸秆中蛋 candidium) 质 白质由48提高到67g/kg 酿酒酵母(S. cerevisiae) 经紫外诱变得到能于43℃ 选育出能耐受55℃高温的 Shi 生长的两突变株进行融合 融合菌株
原生质体融合技术的方法
原生质体融合育种一般包括如下步骤： ①标记菌株的筛选； ②原生质体的制备； ③原生质体的再生； ④原生质体的融合； ⑤融合子的选择； ⑥实用性菌株的筛选。
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降解细胞壁所用酶类： 降解细胞壁所用酶类：
处理细菌细胞壁用酶： 处理细菌细胞壁用酶：溶菌酶Lysozyme 处理放线菌细胞壁用酶： 处理放线菌细胞壁用酶：Lytic Enzyme裂解酶、Lysozyme 溶菌酶 处理真菌用酶：纤维素酶Cellulase、酵母裂解酶 处理真菌用酶： Zymolyase、β-1,3葡聚糖酶、几丁质酶Chitinase、 Novozyme234(来自Trichoderma harzianum)、 Lywallzyme(广东微生物研究所溶壁酶) 、Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 (for yeast)、蜗牛酶snailase
碱性脂肪酶产生菌扩展青霉 (Penicillium expansum) 曲霉BI 紫杉醇产生菌多节孢属 (Nodulisporium sylviforme) 产泰勒菌素的弗氏链霉菌 (Streptomyces fradiae) 乳杆菌 Sphingobilum chlorophenolicum 羟基柠檬酸生产菌Streptomyces sp. 核黄素生产菌Bacillus subtilis 柔红霉素生产菌 抗生素产生菌比基尼链霉菌 (Streptomyces bikiniensis)
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原生质体融合技术及方法简介
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提高代谢产物的产量和质量 提高菌株降解能力 提高菌株抗受性 改良菌种的遗传特性 获得新代谢途径和性状
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Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology 融合亲本菌株 产普纳霉素始旋链霉菌 （ S ． pristinaespiralis ） CGMCC0957突变菌 多杀菌素产生菌 Saccharopolyspora spinosa 黑 曲 niger) 霉 融合子 融合结果 4株突变产量较高菌株融 得到普纳霉素产量比亲本 合 高89.4%，达到0.89g/L的 优良菌株 10株产量较高的菌株进行 多 杀 菌 素 产 量 可 达 到 融合 547mg/L ， 较 出 发 菌 提 高 200.55% (Aspergillus 经 紫外 或EMS 诱变， 筛选 葡萄糖氧化酶产量最高为 胞外葡萄糖氧化酶活性最 62.7u/ml，较亲本提高了 394.3% 高菌株进行融合 对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合 作者 Xu
德氏乳酸杆菌突变株和淀粉 基因组三轮改组 酶 产 生 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)

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基因组重排技术
20世纪90年代，美国加州Maxgen公司在原生质体融合技术的基础上提出了基因 组重排技术（genome shuffling）技术的概念，基因组重排技术是经典微生物诱变育种 技术与原生质体融合技术的有机结合。首先对微生物菌体进行诱变，筛选出正向突变 菌株，然后通过原生质体“递推式融合”使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合， 筛选出符合育种要求的融合子，从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株。由 于此技术在无需了解微生物遗传性状的条件下即能实现微生物的定向育种，获得正向 突变的菌株，自此技术诞生以来，短短几年时间里在工业生产菌种改进及开发方面就 获得了成功的应用。
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原生质体融合的优势
打破了微生物的种界 界限，可实现远缘菌株 的基因重组。可使遗传 物质传递更为完整、获 得更多基因重组的机会。 可与其他育种方法相结 合，如把常规诱变和原 生质体诱变所获得的优 良性状，组合到一个单 株中。
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Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology 改组菌种 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) 干酪乳酸菌(Lactobacillus casei) 德氏乳酸杆菌突变株和淀粉酶产 生菌(Bacillus amyloliquefaciens) 产纤溶酶的枯草芽孢杆菌 纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus) 替考拉宁产生菌SIIA 01-11-25 异亚硝基酸产生菌 (Streptomyces sp.) 3株酿酒酵母菌 2 3 改组次数 2 改组结果 15%葡萄糖36h发酵产乳酸 135.6g/L，提高葡萄糖耐受性及 产酸能力 产酸能力提高2.4倍，提高耐酸 性 产生能直接利用淀粉产乳酸，产 量40g/L，淀粉转化率96% 酶活1600U/ml以上，较亲本提高 4-5倍 产量提高到3574mg/L，较亲本提 高1.5倍 产量提高65.3% HCA产量最好194mg/L，是野生型 的5-6倍 作者 于雷