• 盐类融合的优缺点
–优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 –缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发 融合
B. 高Ca2+和高pH值融合
• Ca2+浓度 0.05 mol/L • pH 9.5-10.5
具体做法(以烟草为例)
• 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的 比例混合; • 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; • 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液， 同时在37℃下保温0.5h; • 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； • 两种原生质体的融合率达到10%。
•
器官形成植株再生：
– 从愈伤组织诱导发生 – 胚状体发育
3、原生质体培养成功的技术关键
• 原生质体的活力
–影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度， 质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间
• 原生质体密度
– 起始密度一般为104-105 个/mL
• 细胞壁再生速度
– 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时 所用质膜稳定剂种类
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
3、原生质体的分离
A、原生质体的分离方法
★ 机械分离法 －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分 离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤 口处可以释放出完整的原生质体。 －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。 ★ 酶解分离法 – 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、果酸酶等 – 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或 它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及 酚类物质。影响所获原生质体的活力。
电融合基本过程
1. 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型 只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm， 整个装置放在一个培养皿中
◆ 聚乙二醇（PEG）融合法
◆ PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ◆ 电融合法
回顾：诱导动物细胞融合的方法 1、病毒诱导细胞融合 2、化学融合剂诱导细胞融合
3、电融合法
A. 盐类融合法
• 盐类融合剂种类
–硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 –氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 –葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠
• 细胞融合的意义：
– 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 – 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件
2、植物细胞融合的程序
◆ 原生质体分离的分离、纯化 ◆ 融合方法选择 ◆ 杂种细胞的筛选 ◆愈伤组织形成器官分化植株再生
◆杂种植物的鉴定
3、诱导原生质体融合的方法及融合剂
◆ 盐类融合法 ◆ 高Ca2+和高pH值融合
C、分离原生质体所用的酶液和稳定剂
▲ 烟草叶肉细胞：0.5% Macerozyme R-10果胶酶+2% Onozuka R-10纤 维素酶，0.7M 甘露醇。 ▲ 烟草悬浮细胞： 2% Driselase纤维素酶+2% Cellusase纤维素酶+ 0.5% Macerozyme果胶酶；海水。 ▲ 胡萝卜悬浮培养的细胞：2% Onozuka纤维素酶+0.5% Driselase纤维 素酶+0.5% Rhoxyme半纤维素酶1% Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇 + 0.35M 山梨醇 ▲ 甘蓝等的根细胞：4% Maicelase纤维素酶+2% Rhozyme半纤维素酶 +0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。 ▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。 ▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1% Pectolyase果 胶酶 ；0.3M 葡萄糖
1、原生质体的培养方法
• 固体培养法
– 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培 养基中 – 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形 成的全过程进行定点观察
• 浅层液体培养法：
– 在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将 纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养
◆融合细胞的鉴定
三、植物原生质体的融合
1、植物细胞融合的概念和意义 2、植物细胞融合的程序 3、诱导细胞融合的方法及融合剂 4、细胞融合的影响因素
5、细胞杂种的选择和鉴定
1、植物细胞融合的概念和意义
• 细胞融合(cell fusion)概念：
– 又称细胞杂交(cell hybridizaion)：离体条件下用人工的方 法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
◆ What
◆ Why
基本原理
技术应用
◆ How
技术方法
植物细胞模式图
高尔基体
微丝 叶绿体 线粒体 质膜
液泡
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
◆ What
• 原理：
– 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变， 使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始 连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。
• 优点：
– 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、 方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG 诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。
C. 聚乙二醇（PEG）融合法
• Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式 H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 • 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和 原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电 键，促使异源的原生质体间的粘着结合 • 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用 培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核 体
植物原生质体在理论研究和细 胞工程中的地位
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器
膜的结构与功能
核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理 诱发突变体
引入各种细胞器
导入外源基因
纯化后的叶肉原生质体
2、原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
与 分 离 试 剂 相 同
-5.6
与 分 离 试 剂 相 同
21% 5.6
4).原生质体的活力测定
形态：
把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体 释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可 见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常 膨大的一般是有活力的原生质体。
染色法：
用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色 用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，在荧光显微镜下 观察到带有荧光的是有活力的原生质体
D. PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法
• 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质 体表面间的分子桥） • 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG； （引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布， 从而促进了融合） • 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值
PEG诱导原生质体融合过程
E. 电融合法
在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复 此步骤3次，使酶解液充分除去； 最后用原生质体培养液离心一次
分离、洗涤、纯化原生质体 的试剂
试剂 KH2PO4 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KI CuSO4.5H2O 甘露醇 纤维素酶 果胶酶 蔗糖 pH 分离 27.2 mg 101 mg 1480 4% 0.4% -5.6 洗涤 纯化
B、影响原生质体数量和活力的因素
1）不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构 有差异 2）渗透压稳定剂：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类 （KCl,MgSO4.7H2O)等 3）质膜稳定剂：如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等增
加对质膜的稳定性
4）酶液的pH值：一般在5.4-6.0 5）温度因子 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状态、栽培条件等对 取材影响很大
4、原生质体的纯化
• 去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质 A、过滤法
B、漂浮法
C、离心法
例: 烟草叶肉细胞原生质体的 分离
1). 材料的准备与消毒： 2). 酶解： 3). 纯化： 4). 原生质体的活力测定
1). 材料的准备与消毒
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
技术方法
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 植物原生质体的制备 • 植物原生质体的培养 • 植物原生质体的融合
一、植物原生质体的制备
• 原生质体的概念及培养的意义 • 原生质体材料来源 • 原生质体的分离