RT ds cDNA
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A 消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测：Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
HiSeq 2000 sequencing 101PE
生物信息学分析
RNA-Seq (Transcriptome)
Technique
2
Characterize the transcriptome in unparalleled detail
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)
RNA-Seq (Transcriptome resequencing)
20
RNA-Seq (De novo transcr主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用TrisHCL在加热条件下解离洗脱到溶 液中。
EST 测序
O/X
筛选分子标记
O
转录融合基因 表达
O/X
Small RNA 测序
Small RNA
O
降解组测序 mRNA
Non-coding RNA测序
Non-coding RNA
O
O
O
O
O
X
X
O
X
X
X
O
O
X
X
X
X
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
PCR
↓
PCR胶回收
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
LNA扣锁型探针
mRNA反转录---fragment+RT
纯化过的mRNA样品加入 1 µl的fragment buffer 70℃ 作用1.5min。
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层 次
遗传的中心法则
什么是转录组？
All transcripts
All mRNAs
RNA是解读基因组的关键
Genotype
Phenotype
DNA
Protein
RNA
RNA 测序技术
测序技术
RNA-Seq
研究对象
mRNA
鉴定新分子
O
表达谱研究
O
基因结构分析
O/X
检测报告-合格样品
棉铃虫/果蝇
检测报告-不合格样品
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测 OD260/280:1.8~2.2 RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR 工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解 决方案。 ● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板 ● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果 ● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 ● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
真核mRNA的纯化
链霉亲合素包被磁珠+生物素标记 Oligo（dT）25+poly（A）
RNA-Seq (单端测序---Quantification)
√ － －
－
RNA-Seq (双端测序---Transcriptome)
√ √ √ √
HiSeq 2500
17
RNA-Seq (Transcriptome)
Workflow of RNA-Seq(TranscripBiblioteka ome)Total RNA
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification