2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
高通量测序技术（High-throughput sequencing ）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一 般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改 变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列 测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技 术（next generation sequencing）组件其划时代 的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转 录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测序（deep sequencing）
2014-4-1
RNA-Seq 实验流程图
2014-4-1
RNA-Seq 实验步骤
2014-4-1
RNA-Seq 测序数据的分析
2014-4-1
RNA-Seq 提供试验报告
原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有 测序序列信息，碱基读取质量评估 基本数据分析报告（Excel表格），包含有 效序列的序列信息、与参考基因组比对后 的注释信息等。 高级数据分析（应客户要求定制），如基 因覆盖率和测序深度分析，基因表达差异 分析，基因结构分析，鉴定选择性剪切现 象，发现新基因，鉴定基因融合现象。
2014-4-1
RNA-Seq 常见问题
送样要求： 浓度≥400ng/ul，RNA总量≥20ug；OD260/280为1.82.2，28S/18S>1.8，RIN≥8
在进行原核生物转录组分析时需要提供纯化后的原 核生物mRNA或cDNA样品 进行非编码RNA测序时需要提供去除rRNA和tRNA的 RNA样品 测序1Gb的转录组数据时通常可以得到长度大于 500bp的Unigene12000个以上，但转录组大小受基因 数目和基因丰度双重影响，组织差异、状态和实验处 理也会影响转录组组成
请输入课题
讲师：
莫小贝
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2014-4-1
RNA-Seq第一技讲术背景 RNA-Seq第二技讲术原理 RNA-Seq第三技讲术应用领域 RNA-Seq 技术优势 RNA-Seq 技术...面..... 临的挑战及发展
2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序 （transcriptome sequencing）或 称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
测利 之后HelicosBiosicences公司有推出单分子测
测 序公 司
序（Single molecule sequencing,SMS）技术。 新一代测序技术又称作深度测序或高通量测序，
是相对于传统的Sanger测序而言，主要特点是
测序高通量，测序时间和成本显著下降。各平
台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通
2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
寡 鲁 聚
高通量测序法原理美罗国应氏用公生司物系统公司
原则上，所有的高通量测序技术都能进行
米 物 RNA测序，自2005年以来，Roche公司的454
那 连 公 接
技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的
司 检赫 SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生，
2014-4-1
RNA-Seq 技术应用领域
2014-4-1
RNA-Seq 技术优势
* 数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核 苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的 荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 * 高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有 转录本。 * 任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探 针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物 种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新 的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP， UTR区域。 * 更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围， 能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。
2014-4-1
The End
2014-4-1
2014-4-1
数字表达谱与芯片的比较
2014-4-1
RNA-Seq面临的挑战
庞大的数据量所带来的信息学难题 如何针对更复杂的转录组来识别和追踪 所以基因中罕见RNA亚型的表达变化 目前的高通量测序技术大都需要较多的 样品起始量，这使得来源极为有限生物 样品分析受到限制，因此如何对单细胞 或少量细胞进行转录测序是一个亟待解 决的问题
功能：非编码RNA具有调节基因表达的 作用，如对染色体结构、RNA加工修饰及稳 定性、转录和翻译及一些蛋白质稳定性的影 响。
2014-4-1
RNA-Seq 技术原理
把高通量测序技术应用到有 mRNA逆转录生成的cDNA上，从而 获得来自不同基因的mRNA片段 在特定样本中的含量，这就是 mRNA片段或mRNA-Seq，同原理 ，各种类型的转录本都可以用深 度测序技术进行高通量检测，统 称作RNA-Seq。
量测序仪具有不同的应用侧重。
2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
转录组（transcriptome）
广义：指某一生理条件下，细胞内所 有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。 狭义：指所有mRNA的集合。
2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
转录组测序技术：是指利用第二代 高 通 量 测 序 技 术 进 行 cDNA 测 序 ， 全面快速地获取某一物种特定器 官或组织在某一状态下的几乎所 有转录本。
2014-4-1
RNA-Seq 的发展前景
就目前来看，作为两个高通 量的转录组学研究技术，在应用 的某些方面既存在重叠和竞争， 也存在优势互补，一种技术能弥 补另一种技术遗漏的部分，通常 对一个生物学问题的回答需要不 同实验技术的协同配合。2 Nhomakorabea14-4-1
RNA-Seq 的发展前景
RNA-Seq 的强项就是在于它是 一个“开发系统”，它的发现能力 和寻找新信息的能力从本质上高于 芯片技术，相信随着相关学科的进 一步发展和测序成本的进一步降低， RNA-Seq 必将在转录组学研究领 域占主导地位。
2014-4-1
RNA-Seq 技术面临的挑战及发展
RNA-Seq 的发展前景
虽然RNA-Seq的技术还面临着种 种困难，但作为一个刚刚起步的新技 术RNA-Seq出其他转录组学技术无可 比拟的优势：既能提供单碱基分辨率 的转录组注释又能提供全基因组范围 的“数字化”的基因表达谱，而且其 成本通常比芯片和大规模的Sanger EST测序要低。
2014-4-1
RNA-Seq 技术背景
有关于ncRNA的一些知识
非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运 RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核 RNA（snRNA），核仁小分子RNA（ snoRNA），细胞质小分子RNA（scRNA）， 不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（ microRNA,miRNA）等。