植物组织培养技术手册金陵中学河西分校瞿大枞第一部分植物组织培养理论简介实验原理植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。

其理论依据是植物细胞具有全能性。

组织培养的特点取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。

应用领域1、快速繁殖2、种苗脱毒3、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产7、基因工程6、种质保存4、突变育种5、单倍体育种胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化器官发生途径外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)胡萝卜离体根培养条件光照强度：1000lx ——1500lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化光周期：常用的周期是16h 的光照8h 的黑暗温度：25℃湿度pH器材和药品高压灭菌锅超净工作台光照培养架1. 大型仪器和器材1.超净工作台：用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。

2. 高压灭菌锅：用于进行培养基和器械用具的灭菌。

小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。

3.光照培养架：用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。

生化培养箱还配有光照装置。

4.电子分析天平：电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g1.镊子类常应用医疗上的镊子。

根据操作需要有各种类型2.剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。

主要用于切断茎段、叶片等。

也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。

3.解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。

刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。

4.解剖针解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。

也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。

2. 小型仪器和器材组培瓶---要求透光度好，能耐高压高温, 以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。

三角锥瓶---适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。

培养皿---适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。

试管---适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。

3. 玻璃器皿次氯酸钠消毒液, 75%的酒精,0.2％的升汞溶液.1 N 盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖.0.1 mg/ml 的2,4-D 溶液：取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。

0.1 mg/ml 的6-BA 溶液：取25 mg 的6-BA ，用少量1 N 的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250 ml 。

4. 常用试剂的配置标准的组织培养实验室包括洗涤室（准备室）配置室灭菌室接种室培养室观察室等准备室缓冲间(过渡室)接种室(外设缓冲间)培养室第二部分植物组织培养实验操作目的与要求：熟悉MS 培养基的组成，掌握贮备液的配制方法。

实验步骤：称量分别溶解混合定容实验一培养基贮备液（母液）的配制一、MS 培养基的组成1.大量成分→贮备液Img/LNH 4NO 31650KNO 31900MgSO 47H 2O 370KH 2PO 4170CaCl 22H 2O （单溶后加入）440配制20倍浓度贮备液500mL.2.微量成分→贮备液IImg/LKI 0.83H 3BO 36.2MnSO 44H 2O 22.3ZnSO 47H 2O 8.6Na 2MoO 42H 2O 0.25CuSO 45H 2O 0.025CoCl 26H 2O0.025配制100倍浓度贮备液100mL.3.铁盐→贮备液III mg/LFeSO 47H 2O 27.8Na 2EDTA 2H 2O 37.3（长时间放置可能长菌，需要灭菌）4.有机成分→贮备液IVmg/L肌醇100烟酸0.5盐酸硫胺素(VB 1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2配制100倍浓度贮备液100mL.配制100倍浓度贮备液100mL.二、常用生长调节剂6-BA ：1mg/mL(溶于少量1N 盐酸后以蒸馏水定容）。

NAA:1mg/mL （先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。

2,4-D 溶液：0.1 mg/ml （取25 mg 的2,4-D ，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解，再加蒸馏水定容至250 ml ）。

贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO 47H 2O 3.70500mL FeSO 47H 2O278 100mLNH 4NO 316.50Na 2 EDTA 2H 2O373CaCl 22H 2O 4.40生长调节剂KNO 319.006-BA 50mg 50mL KH 2PO 41.70NAA50mg 50mL 贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI 8.3 100mL 肌醇1000 100mL H 3BO 362 烟酸 5 MnSO 44H 2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO 47H 2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na 2MoO 42H 2O2.5 甘氨酸20CuSO 45H 2O 0. 25 称量溶解混合定容CoCl 26H 2O0. 25一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。

二、实验步骤：称量混合调pH 值灭菌实验二固体培养基的配制与灭菌称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。

混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III 、IV 和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。

调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。

灭菌：封严培养容器口后，120 ℃灭菌20 min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。

实验三外植体材料的预处理、消毒及接种一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。

二、方法步骤：（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。

除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。

这在污染严重时特别有用。

（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。

这是进一步减少污染的处理。

同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。

（三）将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。

打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。

（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。

坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。

（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL 消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。

也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。

（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。

在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。

接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。

一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。

无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。

（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。

逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。

如有必要，也可再行切分。

在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。

（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。

（九）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。

实验四枝芽增殖培养基的设计与配制一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养基的设计、配制方法。

二、方法步骤：（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500mL的3/4，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。

（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV及NAA0.25mg，然后1~5各小组再分别加入各自不同量的BA （0.25；0.5；0.75；1及1.5mg ）。

（三）充分混匀后，用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。

定容至500mL。

（四）将培养基分装到所选用的培养容器中，每个容器的装量不超过其最大容量的1/3。

拧紧瓶盖。

（五）将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120℃，20min）。

灭菌结束后从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。

实验五枝芽增殖培养的外植体处理与接种一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养外植体的处理、接种方法。

二、方法步骤：（一）将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30min。

（二）操作人员坐到超净台前，用浸有70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手等部分。