随机引物标记
• 3. 加5μl 10×dNTP混合物
– 10×dNTP混合物: 1.2mM dATP – dGTP – dTTP 0.6mM dCTP 10 mM Tris （pH8.0）
1 mM EDTA
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
随机引物标记
• 4. 加3μl CY5-dCTP或CY3-dCTP （Amersham，浓度为1 mM）； • 5. 加1μl大肠杆菌DNA聚合酶I大片 段； • 6. 37℃温浴1-2 hr，然后加5μl 0.5M EDTA （pH8.0）来终止反应
直接沉淀法
• 1. 加入：6μl 10μg/μl tRNA 6μl 3 mM NaAC 150μl 100%乙醇 -20℃ ，30min 13000 r/min离心 • 2. 75%乙醇洗涤3次，干燥备用
• 4. 取出PCR反应管，-20℃避光保存待 杂交
反转录标记
• 1. 将待标记的样品mRNA （约23μg）加到RNase-free 1.5ml 离 心管中，加适量双蒸水，使体积为 60μl • 2. 向离心管中加入3μl 10μm 的 Oligo dT18 3. 混匀上述试剂后，于72℃变性 5min
PCR标记
• 3. 混匀上述试剂后，将PCR反应管置于 PCR仪中，按下列程序进行PCR反应：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 95℃ 95℃ 55℃ 72℃ go to ① 72℃ 4℃ END 1.5min 0.5min 0.5min 0.5min for 39 cycles 5min forever
反转录标记
• 5. 混匀上述试剂后，于37℃保温 5min或26℃保温10min • 6. 42℃保温60min • 7. 补加反转录酶0.75μl，然后继续 于42℃保温30min • 8. 取出PCR反应管，-20℃避光保 存待杂交
反转录标记
• 9. 用双蒸水调整探针混合物，使体 积为12μl，然后加入2.55μl 20× SSC（使终浓度为3.4×）和0.45μl 10%SDS（使终浓度为 0.3%） • 10. 将杂交混合物
探针的标记和标记产物的纯化
三种标记方法
• PCR标记 • 反转录标记 • 随机引物标记
两种纯化方法
• Microcon 30 filter法 • 直接沉淀法
PCR标记
• 1 将2μ g待标记的样品DNA加入到 PCR 反应 管中 • 2 在冰上，加：
反应缓冲液 25 mM MgCl 2 10 mM dATP–dGTP–dTTP 1 mM dTTP 10 μM 引物混合物 双蒸水 0.1 mM CY5-dUTP Taq DNA 聚合酶 5μl 4μl 1μl 1μl 1μ l 36.5μl 1μl 0.5μl
反转录标记
• 4. 变性后的离心管立即置于冰 上冷却，再加入下列试剂：
5×First Strand Buffer 20μl 0.1M DTT 10μl 10 mM dATP – dGTP – dTTP 2μl 1 mM dTTP 2μl SUPERSCRIPT II 反转录酶 1.5μl 1 mM CY-dUTP 2μl
– 95℃变性1.5min – 37℃温浴30hr（Cot-1预退火） – 和微矩阵杂交
随机引物标记
• 比较基因组杂交中基因组DNA可用 Gibco/BRL的BioPrime DNA标记试剂盒 中简单的随机引物标记 • 1. 将2μg待标记的样品DNA加入一离心管 中 • 2. 加适量双蒸水或TE buffer（pH8.0）， 使总体积为21μl，再加20μl 2.5×随机引 物和反应缓冲液的混合物，煮沸5min后置 于冰上
Microcon 30 filter纯化
（Amicon/Millipore）
• 1. 向已终止的标记体系中加入
450μl（pH7.4）TE • 2. 放在microcon 30 filter中，以 8000g旋涡10min（或在微量离心 机中以10000 r/min 离心） • 3. 以8000g 旋转1min，回收纯化 的探针于一新管（约20－40μl）