如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
7. 琼脂平板涂布分离法 被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取
1～2 滴置于平板中央，用灭
菌的 L 形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分
区划线。如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙
1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，
此法是借助将蘸有
混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线， 使混杂的微生物细胞在平板表面分散， 经
培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培
养基必须事先倾倒好， 需充分冷凝待平板稍干后才可使用； 为便于划线， 一般培养基不宜太
纯培养。
6. 琼脂斜面分离法
取琼脂斜面 3 管，用接种环蘸取欲检病料少许 （如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解
剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织）
，混合于第 1 管的凝集水中，再作
斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第
2 管、第 3 管斜面上作同样划线。划毕，
置 37℃温箱中培养。经此法分离培养后，第 2 管的菌落较第 1 管为少，第 3 管的菌落更少，
通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，
在平板边缘空白处接触一下使接
种环冷却， 然后从接种细菌的部位
图 4-1 连续划线法
图 4-2 分区划线法
在平板上自左向右轻轻划线， 划线 时平板面与接种环面成 30～ 40 度
角，以手腕力量在平板表面轻巧滑
动划线，接种环不要嵌入培养基内划破
培养基，线条要平行密集，充分利用平
5. 实验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在， 可将病料以无菌操作取出， 放入灭菌乳钵或组织匀浆 器内，加 3～ 5 倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下 或静脉）入易感实验动物 ,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑 有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后， 再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌， 可得到
2. 倾注平皿分离法
被检材料若含有两种或两种以上细菌时 ,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后
,
分散的细菌就据材料中存在菌数
的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。其具体方法如下：
取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约
50 ℃，用火焰灭菌接
种环钓取待分离物接种至第一管内， 充分摇匀后， 自第一管取一接种环内容物至第二管， 以
同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于 温箱内培养 24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个 平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待
冷却后放置接种架上。 培 养皿倒置于适
宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板
上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片
镜检为纯种后再接种斜面。
图 4-3 划线分离示意图
(2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划
线法”相似。分区划线法划线分离时平
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板分 4 个区， 故又称四分区划线法。 其中第 4 区是单菌落的主要分布区， 故其划线面积应最 大。为防止第 4 区内划线与 1、2、 3 区线条相接触，应使 4 区线条与 1 区线条相平行，这样 区与区间线条夹角最好保持 120 度左右。 先将接种环蘸取少量菌在平板上 1 区划 3-5 条平行
离出纯的病原菌。 细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，
然后钓取可疑
菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求
1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法
线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动
60～ 70 度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷
却后， 再按以上方法以 1 区划线的菌体为菌源， 由 1 区向 2 区作第 2 次平行划线。 第 2 次划
线完毕， 同时再把平皿转动约 60～ 70 度，同样依次在 3、4 区划线。 划线完毕， 灼烧接种环，
关上皿盖，倒置于 37℃恒温箱中培养 24h 后，在划线区观察单菌落。
学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。 （ 2）杀菌作用 将病料如结核病料用 15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核
杆菌因具有抗酸性而存活。
（ 3）鉴别作用 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某 种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
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实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察
在细菌学检验中， 细菌的分离培养是重要的基本技术之一。 从混杂微生物中获得单一菌 株纯培养的方法称为分离； 纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞
分裂、 繁殖而产生的后代。 分离培养的目的在于从被检材料中， 或者从污染的众多杂菌中分
薄，每皿约倾倒 20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划
线法（图 4-1）和分区划线法（图 4-2）两种。划线法示意图见图 4-3。
（ 1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。 将菌种
点种在平板边缘一处，取出接种
环，烧去多余菌体。 将接种环再次
37 ℃
3. 芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于
80℃水浴箱中维持 15～ 20 分钟，或 85℃加热 10 分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的 细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
4．利用化学药品的分离培养法 （ 1）抑菌作用 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制 作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离， 例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化