第八章 克隆基因的表达
目的基因分离后，对研究者来 说最重要的就是了解基因的功能。 只有当一个基因能正常表达时， 我们才能了解基因的内幕。
基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到 蛋白质的过程
Operator promoter Structural gene terminator
G1
G2
G3
一、影响外源基因表达的因素
-1 +1 +30
TTGACA
- 35元件
15~20bp
TATAAT
- 10元件
6bp
CAT
启动子
启动子
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
TTGACA
-10 区序列
GATAC T
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
终止密码子对翻译的效率有很大影响. UAA,UAG,UGA
4 表达系统对表达产物的影响

表达载体和受体细胞共同组成了外源基因 的表达系统.
二、外源基因在原核细胞中的表达
Operator promoter
Structural gene
terminator
G1
G2
G3
(一)、原核生物基因表达的特点

二、 外源基因在真核细胞中的表达
真核细胞做宿主表达系统的优点 能够识别和除去外源基因中的内含子,剪接加工形 成成熟的mRNA,包括5’端加帽和3’-端加尾 真核细胞将表达的蛋白质糖基化 缺点: 选择标记及选择系统只有少数几个 转化效率低,只有10-6~10-4 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一 定的自发性和盲目性,整合的拷贝数和位置还不能 控制 细胞培养和细胞挑选的要求比较高

-10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA

tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动 子
2.Shine-Dalgarno（SD）序列

位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处 的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤 核苷酸， 5’ UAAGGAGG 3’，，它通 过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体 上，从而启动翻译；
1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码 子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。 2、顺式作用元件 顺式作用元件对基因转录起始的调控 启动子 增强子 沉默子 顺式作用元件对转录终止的调控 终止子 衰减子
启动子
是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段 DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要 特征: 序列特异性: 方向性:结构一般是不对称的，正反两个 方向只有一种具有启动功能 位置特异性 种属特异性:
(2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响
SD序列下游的碱基若为AA率则分别 是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个 碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳 的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、 UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍

内在终止子 依赖ρ 因子的终止子
（intrinsic terminator)

(ρ - dependent terminator ）
4.衰减子

指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成 速率的调节区。能够与mRNA作用形成独 特的结构，终止转录。
原核生物的选择标记基因

Amp, Tet, St 等
(二)、原核生物基因表达的调控序列

原核生物基因表达的调控序列主要涉及启 动子,S-D序列,终止子,衰减子等序列
1.原核生物启动子结构
启动子 :是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列 ,是基因表达不可缺少的序列.
保守序列

-10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT -35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶σ 亚 基的识别与结合位点
mRNA上一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，叫 Shine-Dalgarno（S-D）序列
原核表达系统的注意事项




通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导 宿主菌酶系统合成外源蛋白 外源基因不能带有内含子,必须用cDNA或全 化学合成基因 外源基因与表达载体连接后形成正确的开放 阅读框架(open reading frame)。 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
(3) SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成
蛋白的主要因素之一。在很多情况下，SD序列位于
AUG之前大约七个碱基处。在此间隔中少一个碱基 或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降 低
3.终止子结构
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往有一特定的核 苷酸序列,有终止转录的功能,这一序列称为转录终止子, 简称终止子. 转录终止过程包括: DNA聚合酶停留在DNA模板上不再前进，RNA的延伸停止； 完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来； RNA聚合酶从模板上释放出来。 特点:有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C区 域又具有回文对称结构,转录后形成的RNA具有茎环结构, 并且有与A/T富含区对应的一串U.





只有一种 RNA 聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所 有的RNA合成。 以操纵子为单位，数个相关的结构基因与其调控区结合 形成一个表达的协同单位 转录和翻译偶联、连续进行。 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 调控主要在转录水平上 mRNA的核糖体结合位点上含有一个转译起始密码子及 同16S核糖体RNA末端互补的序列,即Shine-Dalgarno （S-D）sequence
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
lac
3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌 体蛋白连接在一起的。 优点： 可诱导高效表达 载体内含有lacI阻遏蛋白基因 融合蛋白的分离和纯化方便 使用凝血酶和Xa因子可以从表达的融合蛋白中 切下所需的蛋白质和多肽 用EcoRI从rgt11载体中分离的基因可直接插 入Pgex-1rT中
pIN III系列：pINIII comA1-3





强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子 调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG 分泌信号肽 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa 插入位点区（多克隆位点）。 Ipp---lac-----lacO----S-D/ATG—ompa----插入位点 pIN III-comA1 以pBR322为基础构建的 调节基因不必借助于宿主的lacI.

P
如pKK223-3 载体
S-D
结构基因
TAG
pKK223-3 载体
强启动子: tac（trp-lac） 操纵基因：乳糖操纵子系统。 调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统， 如JM105 终止子：rrnB核糖体RNA的强终止子 S-D序列和插入位点区 载体的其余部分：来自pBR322质粒 表达诱导物IPTG（乳糖的类似物，不会被降 解） 必须选择一个有lacI的宿主菌

2.分泌型表达载体- pIN III系列


除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分 泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式 可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋 白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸， 从而达到维护目标蛋白活性的目的。 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号 肽连在一起。

(五)、提高外源基因表达水平的策略





选择强启动子序列，如tac 等 调整S-D序列与AUG碱的距离，一般为5-9bp 改变起始密码下面的几组密码子 增加mRNA的拷贝数和稳定性 减轻宿主细胞的代谢负荷 提高表达产物的稳定性
减轻宿主细胞的代谢负荷
常用的方法有: 诱导表达:使细菌的生长与外源基因的表 达分开.一般用温度或药物诱导 表达载体的诱导复制:将宿主菌的生长和 表达质粒的复制分开
翻译是mRNA指导多态链合成的过程,包括 多态链合成的起始,延伸和终止过程 翻译起始对基因表达的影响
原核生物起始密码子(AUG),SD,SD序列与起始密码之间的 距离保持在9±3个核苷酸;真核生物的5’端帽子结构,起始密 码子周边共有序列,有效的ORF是翻译所必需


密码子偏爱的影响 翻译终止的影响
增强子
远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列, 由多个元件组成,每个元件可与一种或多种转录调 控因子结合.最早在SV40中发现,作用方式特点: 双向作用 提高转录效率 无位置效应 远距离作用 组织特异性:只能在特定组织中增强与其相连的 启动子的活性 无基因特异性
沉默子
(三)、几种常用的原核表达载体
1.
2.
3.
pkk233-3:非融合型表达蛋白载体； PIN III: 分泌型克隆表达载体； pGEX:融合蛋白表达载体。
1.非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的 任何蛋白质融合在一起 优点:产物结构接近于真核细胞体内的蛋白 质结构,其表达产物的生物学功能也就更 接近生物体内天然蛋白 缺点:容易被细菌蛋白酶所破坏.

Foreign DNA P SD
融合型表达载体
融合基因
启动子：tac 操纵基因：lacO， 调节基因：lacI S-D序列， ori：pBR322 ori， S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI--Ptac----lacO---S-D/ATG---GST---基因插 入位点---TGA