（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。
（二）培养细胞
由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养细 胞的生长速率和生长时期。 频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以处 于对数生长早期的细胞为好。即： 频繁继代（每2~3天继代1次）的悬浮培养物以及 处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。 利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细胞 壁的再生和细胞的分裂和分化。
和破碎的原生质体。
（二）接口法
1、方法：
先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（21%），再小 心的加入过滤处理的酶-原生质体混合液，以合适的速度离心， 原生质体将聚集于两液面之间。小心取出原生质体转入另一 离心管，用清洗介质清洗、离心，重复3次。最后以适当的密 度悬浮于液体培养基中。
2、优劣 该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但 采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。 用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度， 使原生质体漂浮于单一界面，且不影响原生质体的稳定性和 活力。
1、叶片 叶片来源丰富，供应及时，有明显的叶绿体存 在时也便于在细胞融合中识别。 2、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料 3、愈伤组织或悬浮培养细胞。
（二）分离原生质体的方法
1、机械分离法 2、酶法分离
酶法分离是利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类 降解细胞壁成分，获得原生质体的方法。
（1）分离原生质体的酶类 （2）酶解分离原生质体的方法 （3）酶解分离原生质体应注意的问题 根据植物材料种类选择所用酶的种类、处理浓 度、和处理时间。 酶解分离时应提供适宜的渗透压保护，以防原 生质体破裂。
不同植物适宜于分离原生质体的材料
不同科属的植物其材料特性存在差异，适宜于游离原生 质体的供体材料也异。
（1）茄科
一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片。 （2）十字花科
种子萌发4-5天的无菌苗的下胚轴为材料，具有原生质体 得率高、活力强、再生频率高等优点。
（3）豆科
以未成熟种子的子叶为材料。
原生质体培养一般采用液体培养
1、有些物种的原生质体不能在固体培养基上分 裂。 2、采用液体培养有利于调整培养基成分。 3、采用液体培养可将经过几天高密度培养之后
的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。
（一）液体浅层培养
1、方法 把原生质体以一定的密度（约2×105个/mL）悬浮在液体 浅层培养基中（浅层的厚度以1mm为宜），用石蜡膜封住平 皿后，放在适宜条件下培养。 2、优劣
（二）渗透压
原生质体再生细胞壁之前，必须在培养过程中 提供适宜的渗透压保护。 1、在原生质体培养中，一般常用的渗压剂有甘露醇、 山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等。 2、在原生质体培养中不宜使用电解质渗压剂。 3、原生质体再生细胞壁后应使培养基的渗透压逐步 降低。
（三）植物激素
1、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要 求存在较大的差异。 2、生长素中常用的是2,4-D、NAA，在细胞分裂素
1、酶种类、处理浓度、处理时间
（1）对于胚性愈伤组织、悬浮培养细胞
常用活性较强的酶的组合，如Cellulase RS、Pectolyase
Y-23、Rhozyme HP150，并且酶处理浓度应高些，用量应大 些。 （2）对于叶片、子叶、下胚轴等材料 常用Cellulase R-10 、Macerozyme R-10、Hemicellulase
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离 （一）分离原生质体的材料来源 （二）分离方法
1．机械分离法
2．酶法分离
（三）技术程序
二、原生质体的纯化
（一）分离原生质体的材料来源
游离原生质体时，植物叶片、花瓣、果实组织、子叶、 下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等都可作为材料 来源，但常用于分离原生质体的材料为：
1、方法 取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至45℃的含琼脂或 琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀 分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器内。
2、优劣
有利于原生质体均匀分布； 便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、 分裂等行为； 也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。
第三节 原生质体的培养
一、影响原生质体培养的因素
（一）基本培养基
（二）渗透压 （三）植物激素 （四）氮源 （五）复杂有机物 二、培养方法 三、培养密度
四、培养条件
（一）基本培养基
1、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且 培养基的基础成分多采用B5或MS培养基的配方。如 KM8P和K8P培养基： 以B5培养基为基础 NT培养基： 以MS培养基为基础 2、不同植物常采用的培养基 禾本科植物： MS、N6、KM； 十字花科和豆科： B5、KM8P、K8P、KM； 茄科： MS、NT、K3
①两步分离法 这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使 植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤
后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。
②一步分离法
即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，
对材料进行一次性处理，处理温度25~30℃，处理的
时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2～24h。
（三）游离原生质体的技术程序
（4）禾本科 用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体建立胚性愈伤组 织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体。
二、预处理
1、依据材料特性进行表面灭菌 2、促使酶液渗入组织细胞内的措施 （1）撕去叶片的下表皮，将无表皮的一面向下 漂浮在酶溶液中。 （2）将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片，投 入到酶溶液中。 （3）真空渗入促使酶液渗透。 （4）酶处理期间进行搅拌或振荡。
（2）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结合 使用。 （3）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要 求较高的生长素/分裂素配比才能进行分裂； 由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体， 常需要较高的分裂素/生长素配比才能进行脱分化。
（四）氮源
许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质 体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。 NH4+浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养 基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体 有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中 NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂 都有利。 还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产生毒 害作用，因此使用时应特别注意其用量。
中最常用的是BAP、KT、2-IP。
3、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、
愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗），
需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调
整。
（1）在原生质体培养中，加入2,4-D对于原生质
体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈伤
组织是很有效的，如禾谷类植物。
（1）分离原生质体的酶类
酶的类型
纤维素酶
作用
常用种类
半纤维素酶
果胶酶
降解细胞壁中纤维素成分， Onozuka R-10 游离原生质体。 Phozyme HP-150 降解细胞壁中的半纤维素 成分。 降解相邻细胞间的果胶质， Macerozyme R-10 使细胞游离。
（2）酶解分离原生质体的方法
第二节 影响原生质体产量 和活力的因素
一、材料来源 （一）植物叶片 （二）培养细胞 二、预处理 三、酶处理 四、渗透压
（一）植物叶片
当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环 境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。 １、植株年龄 对一年生草本：生长40-60天的幼叶； 对多年生木本：幼龄且充分展开的叶片。 ２、母株生长环境 母株生长在低光强（10001x）、短日照、温度 20℃~25℃、相对湿度60％～80％的条件下，以及较 高的氮肥供应。 ３、采用离体苗叶片
优点是：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基 与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止 了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新 鲜培养基。
缺点是：原生质体分布不均，易造成局部密度过高或 原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育； 难以实施定点观察和跟踪观察。