实验一植物组织渗透势的测定(质壁分离法）实验目的：观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的方法。

原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时,细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势.该溶液的浓度称为等渗浓度。

当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度.代入公式即可计算出渗透势。

器材与试剂：1．显微镜、载玻片及盖玻片、镊子、刀片2．100mL浓度为1mol/L蔗糖溶液:用蒸馏水配成0.1、0。

15、0.20、0.25、0。

30、0.35、0。

40、0。

45、0.50mol/L的蔗糖溶液各50mL。

称34。

23g蔗糖用蒸馏水配成100ml,其浓度为1mol/L（母液）。

再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.45mol/L：吸母液22。

5ml+水27。

5ml0。

40mol/L:吸母液20。

0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17。

5ml+水32.5ml0.30mol/L:吸母液15.0ml+水35.0ml0。

25mol/L：吸母液12.5ml+水37。

5ml0。

20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0。

15mol/L：吸母液7。

5ml+水42.5ml0。

10mol/L：吸母液5。

0ml+水45。

0ml3．实验材料洋葱鳞茎实验步骤：将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。

撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5—10分钟。

1． 从0.5mol/L 开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片,于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。

2． 实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度,和不引起质壁分离的最高浓度.3． 在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。

在此条件下,细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。

将结果记录下表中。

测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。

RTiC s =-ϕs ϕ-为细胞渗透势.R 为气体常数=0。

083×105/L ·P а/mol ·K.T 为绝对温度，单位K,即273℃+t ，t 为实验湿度。

I 为解离系数,蔗糖为1.C 为等渗溶液的浓度，单位为mol/L 。

则：s ϕ-=0。

083×105×（273℃+t )×1×C作业与思考题：1． 绘制细胞质壁分离前后的细胞图。

计算植物细胞的渗透势.实验二植物组织水势的测定（小液流法）实验目的:了解植物组织中水分状况的另一种表示方法及用于测定的方法和它们的优缺点。

实验原理:植物组织的水分状况可用水势来表示。

植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。

将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势）,则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。

组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化.根据这些参数的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液.可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。

仪器药品:试管、毛细滴管、移液管、剪刀、镊子、甲烯蓝、菠菜叶片操作步骤：1．首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液(0。

1、0。

2、0。

3、0.4、0.5、0。

6、0.7、0.8mol/L ）各10ml 注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号.按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。

2．另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。

然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml 移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。

3．用剪刀将菠菜叶剪成约0。

5cm 2大小相等的小块60—80片。

向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片)的叶片小块，塞好塞子,放置30分钟，在这段时间内摇动数次,到时间后，用大头针沾取少许甲烯蓝粉末加入每一试管中,并振荡，此时溶液呈蓝色。

4．用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部,缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。

如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡,比重比原来小了；如果有色液向下移动,则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。

记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度.重复测定一次。

按RTiC w =-ϕ计算水势。

式中w ϕ-为细胞水势。

作业与思考题:1． 计算植物细胞的水势。

为什么蓝色试验液滴不动说明试验溶液的密度等于对照溶液？实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定（纸层析法）实验目的：了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。

实验原理：叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质,主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,可用丙酮提取。

并可根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分离开.分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。

器材与试剂：大试管、台天平、研钵、量筒、烧怀、漏斗、软木层、新华滤纸;丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、碳酸钙、石英砂操作步骤1．称取新鲜叶子2g,放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮5ml,然后以漏斗过滤之，即为色素提取液.2．取准备好的滤纸条(宽2cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽约0。

5cm 的窄条，如图。

3．用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方,注意一次所点溶液不可过多。

如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次.4．在大试管中加入四氯化碳3—5ml及少许无水硫酸钠.然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内,使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。

5．经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。

最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a,最后的黄绿色为叶绿素b。

6、铜代反应取上述色素丙酮提取液少许于试管中,1滴1滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色,此时叶绿素分子已遭破坏,形成去镁叶绿素。

然后加醋酸铜晶体少许,慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。

此即形成了铜代叶绿素。

作业与思考题：1．绘制叶绿体色素的柱层析图谱提取叶绿素时为什么要加入少量CaCO3,加多了会出现什么问题?实验四叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

实验原理：如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异,但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分,可根据Lambert—Beer定律，通过代数方法,计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量.如图叶绿素a和b的吸收光谱曲线,叶绿素a的最大吸收峰在663nrn,叶绿素b在645nrn，吸收曲线彼此又在重叠。

根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系: A1=Ca·k a1+C b·k b1A2=Ca·k a2+C b·k b2式中：Ca为组分a的浓度，g／L.Cb为组分b的波度，g／L。

A l为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。

A2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时,混合液的吸光度A值。

k al为组分a的比吸收系数,即组分a当浓度为1g/L时,于波长λ1时的吸光度A值.k b2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g／L时，于波长λ2时的吸光度A值.k a2为组分a（浓度为1g/L）在波长λ2时的吸光度A值。

K b1为组分b（浓度为1g/L）在波长λ1时的吸光度A值.从文献中可以查得叶绿素a和b的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L时,比吸收系数k值如下：ε：波长（nm）叶绿素a 叶绿素b663 82.04 9.27将表中数值代入上式（1）、(2），则得：A663=82。

04×Ca+9.27×C bA645=16.75×Ca+45。

60×C b经过整理之后，即得到下式：C a=0.0127A663－2.69A645(3）C b=22.9A645－4.68A663（4)C T=C a+C b=8。

02A663+20.21A645(5)（5）式中C T为总叶绿素浓度,单位为mg/L。

利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。

注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663—645nm)，难以达到精确测定.此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了.根据公式计算往往会得到叶绿素a∶b值小于1，这就不很奇怪了。

除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致.校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650-670nm和630—650nm之间，每隔1—2nm 测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。

如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子,松动波长刻度盘紧固螺丝,调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器.为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得.取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可.然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚.层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区.最后分别浸于80％丙酮中,洗下叶绿素a和b。