分子伴侣亲和色谱介导蛋白质的复性同它在 溶液中的作用一致。即分子伴侣在复性蛋白质时, 为变性的蛋白提供一个中空环状疏水腔,当变性蛋 白质进入空腔后,可部分避免或完全消除变性蛋白 质分子间的相互聚集作用,使蛋白质在疏水环境下 进行“结合-释放-再结合”的循环过程, 直到其恢复 到天然的构象状态。
目前英国剑桥大学的一个研究小组在这一领域 中做得最好。他们合成了几个复杂的固定相体系 用于蛋白质复性,使这些在溶液中无法复性的蛋白 质在柱子上得到了好的复性,并称之为折叠色谱
包含体形成的原因
1. 蛋白质高效表达的结果 在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶
蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%～50%， 蛋白质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成 正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而 不溶。
2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子
对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一 种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没 有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制, 例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完 成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折 叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全 适应较复杂真核蛋白质的折叠。
直链糊精
存在的问题：
分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并 需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分 子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工 业规模的包含体复性。
蛋白质的色谱复性及其纯化
液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手 段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间 作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利 用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而 避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的 过程中实现了蛋白质的复性。
包含体的复性
贾凌云
基因工程产Байду номын сангаас目前的研发状况
目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种, 其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白 质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在；
用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。
存在的主要问题
复性效率低：常用的复性方法—稀释和透 析法的复性效率为5-20%；
(Refolding chromatography)
疏水色谱（HIC）
复性机理:
当蛋白质、变性剂和杂蛋白质进入HIC系统后,由 于HIC固定相对变性剂的作用力较弱,而对变性 蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白 质分离,并随流动相一同流出色谱柱。又因HIC 固定相能提供较通常方法高出数十乃至数百倍 的能量,在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时 瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固 定相表面接触区域的水分子,而蛋白质的特定的 疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成 区域立体结构(Micro-domain),接着形成折叠
目前用于蛋白质复性分离的色谱方法：
➢ 体积排阻色谱 ➢ 离子交换色谱 ➢ 亲合色谱 ➢ 疏水色谱
排阻色谱（SEC）
复性机理: 在变性蛋白进入柱顶端时,因有高浓度变性
剂的存在,变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水合半径,不能进入柱的空隙,蛋 白质在柱上不保留。当使用复性的缓冲溶液洗脱 时,因其逐步取代变性剂并使变性剂浓度降低,使 变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态, 这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能 态 — 即蛋白质的天然状态转化,从而使蛋白质 开始复性。此时，局部复性的蛋白质可以进入球
分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质 正确构象的一类蛋白质，它参与细胞 内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运 输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中 间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮 助其形成正确的构象。
环糊精的分子结构
其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶 段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分 子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形 成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离 阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分 子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来， 从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白 质。
离子交换色谱
复性机理：不同于SEC之处在于变性蛋白质与 固定相间有分子间的电荷作用,这种作用力可导 致变性的蛋白吸附于固定相表面,在洗脱过程中 进行吸附—解吸—再吸附的复性。
Hamaker将DEAE纤维素卷成柱状装入色谱 柱中,使用等浓度洗脱, 对重组白细胞分泌抑制 因子进行了复性纯化, 用该法复性的蛋白质浓度 比稀释方法提高了6.4倍, 且46%的蛋白质可以获 得复性,质量回收率为96%, 时间只用了5min.
的内部,开始在液固两相间进行分配,随着时间的推 移,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时,蛋白质在 两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填 料的孔隙后,其扩散速度减缓,从而限制了蛋白质的 聚集,这样就减少了沉淀的产生。蛋白质分子大,先 从柱子上洗脱下来,变性剂分子质量小,最后流出色 谱柱。故SEC的主要作用不是变性蛋白质与SEC固定 相间的特殊作用力,而是有利于更换变性蛋白质复 性的缓冲溶液,这里当然更不涉及二硫键是否正确 对接的问题。与稀释法比较,该方法可使溶菌酶、 碳酸酐酶和重组白细胞介素等的蛋白质质量回收率 和活性回收率显著提高。
通过以上制备可获得高纯度的包含体(纯度 高于70%)。
1. 用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用 稀释的方法，一般1-20mol/ml的低浓度条件 下，重组蛋白的复性效果较好。
对小分子的多肽，复性效率较高，对大分 子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。
2. 加入分子伴侣
人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精) 环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性
与杂蛋白分离困难，产品成本高。
包含体
包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时， 表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细 胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的 固体颗粒-包含体。这些基因表达产物的一级结 构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错 误的。
由于包含体具有很高的密度(约1.3mg/mL ) 它们在细胞裂解后可通过低速离心收获。
色谱法进行蛋白质复性的优点是:
①在进样后可很快除去变性剂; ②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地
减少甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性 剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生, 提高蛋白质复性的质量和活性回收率; ③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白 分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进 行; ④便于回收变性剂,以降低废水处理成本。
影响色谱复性的因素
色谱固定相 流动相的组成 变性蛋白质的浓度 蛋白质在柱上的停留时间 流动相的流速、pH、温度
疏水柱的复性分离效果
亲合色谱（AFC）
复性机理：利用配体与目标蛋白质间的特异性亲 和作用,使变性蛋白分子保留在柱的 顶端使其与变性剂分离,而后在洗脱 过程中进行复性的。
按配基类型可分为: 固定化金属亲和色谱 脂质体亲和色谱 分子伴侣亲和色谱
脂质体作为配基对蛋白质复性的原理推测为: 局部变性的蛋白质分子结构类似于融球状态,
中间体(Intermediate),随着流动相的不断变化, 变性 蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再 吸附,并在此过程中逐渐被复性, 形成与天然蛋白质 构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不 同的蛋白质与固定,形成与天然蛋白质构象相同的蛋 白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与 固定相上的作用力强弱不同,复性的目标蛋白质就可 以与大部分杂蛋白进行分离。利用HIC对E.coli 表达 的rhIFN和rhIFNα分别在复性的同时进行了纯化。 rhIFN的GuHCl提取液在40 min内使用一次色谱过程 就可以使其纯度达到85%,活性回收率为稀释法的23倍.
且具有与天然蛋白质相类似的二级结构,此时蛋 白质分子仍然具有强的疏水表面,故可同脂质体 的脂质双层作用以帮助蛋白质进行复性。 例如：用脂质体色谱对失活的碳酸酐脱氢酶进行 复性,其活性回收率为83%,如果使用没有脂质体 的柱子,则回收率便降至58%;如果直接采用稀释 50倍的方法,其活性回收率为52%。
AC
A 聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过
程，速度快，一般在30秒内完成。 复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完
全复性大约需10分钟的时间。
实现蛋白质重折叠的途径
溶菌酶处理→高压匀浆破碎 → 低速离心 包含体沉淀需用去污剂(Triton X-100 或脱
氧胆酸钠) 和低浓度变性剂(如2 mol/L 尿素或盐 酸胍等) 洗涤以除去脂类和膜蛋白。
环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多 肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活， 从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。
直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白 质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直 链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结 合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利 于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便 宜，实际应用前景较好。
如何使包含体复性？
1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白 质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂
SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏 水作用，使其变成松散的水溶状态。
2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折 叠成正确的构象。
蛋白质的重折叠机制
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