酶的定向进化蒋本国范圣第刘宝全(大连民族学院生物工程系大连 116600)摘要酶的定向进化是发展迅速的重要生物工程技术之一耐酸碱性底物特异性使酶更适于工业应用的重要途径本文综述了酶的定向进化的意义并综述了在最近几年内关键词酶定向进化性质改进Some Progresses of the Directed Enzyme EvolutionJiang Benguo, Fan Shengdi, Liu Baoquan(Dalian Nationalities University, Dalian 116600)Abstract The directed enzyme evolution is one of the important bioengineering technologies that was developed rapidly, it is also the necessary way through which the traits of enzymes½«Ã¸´ß»¯ÓÃÓÚ¹¤ÒµÉú²ú±ØÈ»»áÒý·¢Ò»³¡Ðµıä¸ï[1]酶的定向进化是为满足这种需求而改变酶的结构和性质的有效途径近年发展起来的酶定向进化技术使人们可能开发出天然酶蛋白分子不具备的选择特殊环境极地碱湖及盐湖来源的酶可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要[4]1 酶定向进化的策略与途径蒋本国男副教授2003-03-04收稿1.1 对酶实行定向进化的重要意义天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非自然条件的限制经常不能很好地适应环境的转变不稳定性以及苛刻的酶促反应条件酶在活细胞的复杂条件下相反在非水溶液中是活性的(这一点可能在绝大多数生物环境中是不需要的)以及酶能够接受不同的底物(在自然界中不存在的底物)¿Ë·þÕâЩ²»×㵫Óë×ÔÈ»½ø»¯Ïà±ÈÉõÖÁÊÇÊýÖÜ[7]Ò²²»´æÔÚÒ»¸öÄ¿±êø·Ö×Ó¶¨Ïò½ø»¯ÊµÑéÓÐÌض¨µÄÄ¿±ê,要求通过简捷的途径重组等手段得到比较理想的酶功能[8]½«¸Ä±äµÄ»ùÒò¿Ë¡½øÈëÖÊÁ£¸Ä½øøµÄ¿Ë¡±í´ïÔÚ¸ßͨÁ¿É¸Ñ¡Öмø±ðÓëÌôÑ¡¶¨µãÍ»±ä×Ô1980年起用于产生具有增进性质的酶[9]Ô¤²âºÍǶÈëÌØÊâµÄ°±»ùËáµ÷ÕûøµÄÈýά½á¹¹最适温度底物专一性导致具有理想特性的酶的表达大大强化了基因调控的能力再经筛选获得所需的突变株改变反应体系中的Mg2+和dNTPs浓度便可有效的控制所引入的点突变率然后多重这样的小步幅取代变异(每次1»ñµÃÀíÏëµÄø¹¦ÄÜ[11]Ò»ÊÇÏ൱ÂýÈýÊÇÉæ¼°µÄ»ùÒòƬ¶ÎÌ«¶Ì(少于800碱基对)另一种途径是在基因的相对小的区域中定向高水平的随机变异[12]¶¨ÏòµÄ±äÒì¿ÉÄܲúÉúÐµİ±»ùËáÈ¡´úÎï×éºÏÒòΪС²½·ùÈ¡´úÖÐijЩÖмä²úÎï¿ÉÄܲ¢²»ÊÇÓÐÀûµÄ[13]»ò¼Ò×åÖØÅŽø»¯µÄÆæÒì»ùÒò×éÔÚÐòÁпռäÉϱíÏÖ³öºÜ´óµÄ¿çÔ½DNA随机重组称作有性PCR[10]但是与体外方法得到的结果相比其它几种方法如随机前体重组(RPR)[17]随机插入与删除(RID)[19]增长剪截(ITCHY)和DNA随机重组相结合(SCRATCHY)[21]以及交错延伸(StEP)[22]等1.4 成功的酶定向进化的基本要求对成功的定向进化有四个要求(2)这个功能也必须是生物的可行的(4)必须可以针对预期的功能进行快速的筛选[24]ÌØÒìÑ¡ÔñÐÔÌØÕ÷ÍùÍùÄÑÒԸĽø非选择性特征易于改进改进生物功能从不要求的特征或者是对新底物的活性就可以得到较大的改进空间2 酶定向进化研究进展酶的定向进化研究主要集中于改进酶的底物特异性提高热稳定性并用于抗体酶的研究本文择要列举最新的研究结果如下细菌合成生物降解性聚酯聚羟基烷酸酯(PHA)的关键酶方法是集中在PhaC(Ac)基因的一个小的区域中,由易错PCR介导随机突变,然后用聚酯累积方式筛选具有更高活性的酶以谷氨酸取代活性位点上的亲核性半胱氨酸(Cys-161)µ«È´´Ù½øÁ˱û¶þõ£ÍÑôÈ·´Ó¦½øÐÐÓë´Ë¶ÔÓ¦±û°±Ëá¸Ê°±ËáºÍËÕ°±ËáÈ¡´ú°ëë×°±Ëá(Cys-161)对缩合反应不利Zaccolo等[29]对抗生素抗性基因的定向进化并改变了β-内酰胺酶的底物专一性在可以获得两个或多个适当的同类基因的情况下如疱疹单纯病毒1和2的胸腺嘧啶激酶基因的四轮重排后改变了底物的专一性家族DNA重排优于单一基因重排家族DNA重排已经被广泛接受可以用于D-和L-糖并保留了其天然的合成D-唾液酸的活力获得一定成功用一个纈氨酸取代一个活性位点上的谷氨酸对甘油醛活性上升两倍的结果Stemmer等[13]运用DNA体外随机拼接技术对β-内酰胺酶进行改造从中筛选出数百个酶活提高的突变体DNA序列用于下次循环使用E.coli表达体系并使催化活性增加但使用定向进化的方法得到了好几个活性增加5倍以上的突变体硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的耐热菌株HPHmut转化株表现出较高的热耐受力仍然具有可测量的明显的残留活性到82 这个酶仍具有活性分子伴侣以及其它抗热因素存在通过由家族DNA重排得到的2048b-糖苷酶杂交体库的组建检验了杂交体的热稳定性进行了三个循环的筛选１８和20)在70ÆäË®½âÈéÌǵÄÄÜÁ¦·Ö±ðÌá¸ß1.58.6倍[35]Öظ´Á½´Î½ø»¯D-氨基酸酰胺酶值增强约3倍最适温度提高了5V酶的稳定性及催化活性常常剧减提高磷脂酶A的稳定性和催化活性分离出三个具有明显稳定性及催化活性的突变体(SA81%卵磷脂凝胶中实验)ÓëÒ°ÉúµÄø±È½ÏMoore等[38]使用随机突变和筛选从枯草芽孢杆菌蛋白酶E获得了一个突变株Yang等[39]主要使用3个循环的易错PCR及DNA随机重组以及点定向突变大多数可溶性的突变体带有3ËùÓеÄÍ»±äλÓÚ±£ÊØÇøÓòÖ®ÍâÒò´ËÕâЩͻ±äÌå±£ÁôÁËÔ-Óй¦ÄÜÆäÖбàÂëµ°°×ÖʵĻùÒò½øÐÐËæ»úÖØ×齫Ŀ±êµ°°×½Óµ½GFP(绿色荧光蛋白)的N末端GFP才能正常折叠并放出绿光旋光异构选择性是酶的一个最重要的也是难于处理的性质通过随机突变D-乙内酰脲酶的旋光异构选择性发生了反转(从ee D=40%变为ee L=20%)ÖµµÃ×¢ÒâµÄÊÇÐý¹âÒ칹ѡÔñÐԵķ´×ª°üº¬Ò»¸öµ¥Ò»°±»ùËáÈ¡´úµÄ¸ßD-选择性突变体(ee D=90%)也已得到提高拆分能力仅仅经过四代突变就取得了如此巨大的提高经过与热点区域密集突变耦合对应91%ee 和18%的转化率经过三轮DNA 随机重组和筛选对非天然底物1,6-二磷酸果糖2.6 抗体酶的定向进化研究抗体催化剂[42,43](abzymes)一般用过渡态类似物免疫方法产生由Fujii等[44]使用经典的免疫方法完成大多数注意力集中在活性近来的工作利用DNA杂交热力学与重组过程中的退火Sandro等[49]依靠合成的化学信息库利用人结合抗体数据库选择高效率的抗体催化剂并进行定向选择得到的结果显示出芳基磷酸酯酶活性使催化效率改进10倍每个基因中1¶ø¶ÔÓÚ¶¨Ïò½ø»¯Ñо¿¶øÑÔ7个核苷改变(1Daugherty等[50]发展的用于酶的定向进化实验的GeneMorph成套仪器GeneMorph成套仪器是高效创造具有特殊性能的生物催化剂为目的的高通量筛选创造或修饰酶的所有实验中的关键技术提供了测定手性分子中在化学上不活泼的功能基团的新手段这些分析方法适用于微滴定板和高度小型化装置分离具有特殊催化性能的抗体在酶的定向进化方面仍然有许多工作要做如耐热旋光异构选择性等有些酶需要辅助因子或复杂的辅助蛋白究成果尚缺乏处理这些复杂情况的成功方法才能使进化产生多功能酶成为可能高效的生物合成途径将生物催化剂用于工业用途的手段和方法的创新研究也是必要的近年来的研究工作已经取得了非常显著的进展但是要真正达到这一点参考文献[1] W R Cannon, S F Singleton, S J Benkovic. 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