Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11: 325–330
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
得的少量突变累积而产
生重要的有益突变。
DNA改组技术(DNA shuffling)
又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列， 创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 分子种
单个基因的DNA改组
从突变体基因库中分离出来 的DNA片段用脱氧核糖核酸 酶I随机切割
酶活力检测
反应产物显色
pH指示剂显色 对硝基苯酚和伞形酮衍生物等显色底物 分光光度计和荧光酶标仪
通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 GC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析时间 同位素标记底物 质谱 热力学红外检测
噬菌体显示筛选模式
噬菌体表面展 示技术是 Smith 等建立 的一种利用大 肠杆菌丝状单 链 DNA 噬菌体 为载体，在重 组噬菌体颗粒 表面展示外源 多肽分子的展 示技术
定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进 化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需 要。
定向进化与自然进化的差别
定向进化的一般过程
对酶实现定向进化的意义
酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的， 但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结 构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。
pH指示剂显色高通量筛选
产物显色筛选
巨大芽 孢杆菌P 450 BM-3，最适 底物为C 12 C 18 的脂肪酸， 对短链烷烃 羟化活力较 低 两轮易 错PCR，最 佳突变酶的 比活提高了 5倍
Adv. Synth. Catal., 2001, 343: 601-606
荧光产物筛选
通过定向进化，将P450cam的萘羟化活力提高20倍 野生型酶以O 2 为氧化剂，需要NADPH，而突变酶以H 2 O 为氧化剂，无须辅酶
多样性的产生
随机诱变
定向诱变
重组
定向进化的策略
无性进化
易错PCR、化学诱变剂介导的随机诱变、由致突变菌株 产生的随机突变
有性进化
DNA改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法
返回
易错PCR(error-prone PCR)
一种相对简单、快速廉 价的随机突变方法。 通过改变PCR反应条件， 使扩增的基因出现少量 碱基错配，从而导致目 的基因的随机突变。 关键是控制DNA的突变频 率。
突变体基因的构建策略
DNA随机酶切片段拼接
单链DNA随机拼接 （提高不同亲代基因的同源片段重 组形成嵌合体基因的效率） 限制性酶切片段随机拼接 （防止PCR扩增产生相同的 亲代基因）构建突变基因的载体系统Λ噬菌体载体系统
基因构建中最早使用插入片段的装载容量分子定向进化的历史
Sol Spiegelman在20世纪60年 代利用RNA噬菌体Q进行实验， 是第一次在分子水平上定向改 造单一分子。
1981年，B.G.Hall等定向改变E.coli K12中ebg酶的底物 专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。 1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。 1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定 向进化中。 1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。
酶分子的定向进化
从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者 人为获得的）出发，经过基因的突变和重组， 构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预 先期望的具有某些特性的进化酶。
定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）
定向进化的过程
酶定向进化通常分3步进行：
通过随机突变和(或)基因体外重组这个过程可 影响定向进化成功与否 的关键 采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关 借助检测仪器易实现高通量筛选
定向进化的筛选
活体筛选法-基于表形观察的筛选
基于基因编码蛋白质的检测筛选表达 筛选方法根据各个蛋白质的性质而设 计的， 因此，不具有通用性。
噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、 纤毛外操作简便，载体本身的设之处在于：
靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；
中性突变较多；且较为耗时、费力 获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有
一定的密码偏向性。
连续易错PCR(Sequential error-prone PCR)
该方法是将一次PCR 扩增得到的有益突变基 因作为下一次PCR扩增的 模板，连续反复进行随 机诱变，使得每一次获
酶的定向进化
Directed enzyme evolution
达尔文与进化论
达尔文在《物种起源》 中提出以自然选择为基 础的进化学说，成为生 物学史上的一个转折点。
自然进化
环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展
漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组， 产生了遗传多样性
自发、非常缓慢、自然选择 人为引发、较短时间、人为选择？
定向进化的筛选
突变体基因筛选能否成功的关键是将 基因的表型和能通过定量表征的筛选 手段紧密联系。 为加快分离目的基因的过程，已建立 起多种在基因发现上具有“高通量”性 能的筛选方法。
高通量筛选技术
突变微生物分离
琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌， 通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定 反应的出现等判断是否具有目的基因。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将 单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行 分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过 高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细 胞计数仪进行测定。
得到的随机片段经过不加引 物的多次PCR循环
在PCR循环过程中，随机片段 之间互为模板和引物进行扩 增，直到获得全长的基因， 这导致来自不同基因片段之 间的重组
DNA改组与常规定向进化的比较
基因家族改组技术(family shuffling)
DNA改组原理
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4.延伸 反复重复 2 - 4 步后，可获得全长DNA片段
随机引物体外重组法(RPR)
单链DNA为模板 随机序列引物
交错延伸原理
采用基因家族的改组效果明 显高于单个基因的改组效果。
特点
改组基的筛选容量相适应