中 心 法
则
1973年 Cohen 第一例成功的克隆实验
基因工程或称基因重组技术，是将不
同生物的基因在体外人工剪切、组合,并
和载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连
接，然后转入微生物或细胞内，进行扩
增，并使转入的基因在细胞内表达，产
生所需要的蛋白质。

示意图
载 体 DNA (限 制 性 内 切 酶 切 开 ) 目的基因
二、重组DNA技术基本原理
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法
用于已知序列，或可推导出序列的基因酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）
动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录 病毒）
表达载体的条件
① DNA复制及质粒DNA的筛选系统
② 目的基因的转录系统 包括：启动子、抑制物基因和转录终止子 ③ 蛋白质的翻译系统
包括：核糖体的识别位点、翻译起始和终止
密码子
Prokaryotic Expression System
M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因） M13mp系列 pUC系列
Color selection
Blue / White
3. 其他
柯斯质粒（cosmid）
酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC）
根据产物的功能可以分为结构基因（酶和不 直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基 因（阻遏蛋白或转录激活因子）两大类。

下图
1953年: Watson和Crick提出了DNA的双螺旋模型
The double-helical structure of DNA
The semiconservative nature DNA replication
海洋生物工程
主讲人： 马翠萍
青岛科技大学化学与分子工程学院
生物工程，是20世纪70年代初开始兴起的一门新
兴的综合性应用学科。 一般认为是以生物学（特别是其中的微生物学、遗 传学、生物化学和细胞学）的理论和技术为基础，结 合化工、机械、电子计算机等现代工程技术， 充分运用分子生物学的最新成就，自觉地操纵遗传物 质，定向地改造生物或其功能，短期内创造出具有超 远缘性状的新物种，再通过合适的生物反应器对这类 “工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以 生产大量有用代谢产物或发挥它们独特生理功能一门 新兴技术。
（compatible end），可用连接酶连接。
限制性内切酶 识别 特定的
碱基序列
下图
限制性内切酶造成粘性末端
有利于 重组DNA 分子的构建
末端转移酶 在载体及外源 双链DNA的3' 端各加上一段 寡聚核苷酸, 制 成人工粘性末 端,
然后在DNA连 接酶的作用下, 连接成为重组 的DNA.
（三）目的基因
能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的 可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。 其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载 体。
常用的载体：
质粒、噬菌体DNA、病毒DNA
载体的选择标准：

能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于 重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源DNA插入点）， 常具有多个单一酶切位点，称为多 克隆位点； 分子相对较小，一般3-10 Kb
应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。
1. cDNA (complementary DNA) 是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链 cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。
2. 基因组DNA（genomic DNA）
是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
（四）基因
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有 1 ~ 3个抗药
性基因，以利于
筛选。
Eco R Ⅰ
Hind Ⅲ Bam HⅠ Sal Ⅰ
氨苄青霉素 抗性基因 Pst Ⅰ
pBR322
四环素 抗性基因
Ava Ⅰ
Ori
Pvu Ⅱ
2.噬菌体（phage）DNA
获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。
分子克隆（DNA克隆）
细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
DNA克隆：
应用酶学的方法，在体外将各种来源 的 DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的 DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增、提取获得大量同一DNA分子,又称基因 克隆。
生物工程包括5大工程： 基因工程、 细胞工程、 酶工程、 发酵工程、 生物反应器工程。
海洋生物基因工程
（理论）
制作人： 马翠萍
青岛科技大学化学与分子工程学院
基因工程是生物技术的核心部分。
基因
或RNA)的DNA序列。

(gene)
基因是能够表达和产生基因产物（蛋白质
根据产物的类别可以分为蛋白质基因和RNA 基因（rRNA基因和tRNA基因）两大类；
文结构。
5’· · ·· · ·GGATCC · · ·· · ·3’ 3’··· · · ·CCTAGG · · ·· · ·5’
5´-端突出
粘性末端
3´-端突出
平末端 限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端
5’AATTC—— 3’G—— 5’G—— 3’ACGTC——
（二）工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA连接酶 末端转移酶
Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
识别DNA的特异序列，并在识别位
点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、 III三类。II类酶识别序列特点为回
重组体
宿主细胞
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
所以，基因工程的操作包含以下步骤： 获得目的基因 构造重组 DNA 分子
转化或转染
表达
蛋白质产物的分离纯化
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆
克隆（clone）：
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
克隆化（cloning）：