第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1、Restriｃtiｏn and ｍｏdificａｔion（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质(DNA）得现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主得限制作用称为修饰。
２、 Matched enｄｓ（or cohesive ｅnｄ）（匹配末端或粘性末端)识别位点为回文对称结构得序列，经限制酶切割后,产生得相同得，互补得末端称为匹配粘端，亦即粘性末端３、 Blｕｎt ｅndｓ平末端。
在回文对称轴上同时切割DNＡ得两条链，产生得没有碱基突出得末端称为平末端。
4、Ｓtar ａctiｖiｔy星星活性。
在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似得序列，这个改变得特殊性称星星活性。
5、 KlｅnoｗfrａｇｍeｎｔＫｌenow 片段。
KlｅnoｗDNA聚合酶就是E、col ｉＤNA polymｅrase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去5’——3’ 外切活性得多肽大片段,而聚合活性与3＇-—5' 外切活性不受影响.6、Rｅveｒse trａnsｃriｐtasｅ反转录酶。
即依赖于RNA 得ＤNA 聚合酶，它有５’--3＇合成DNA 活性,但就是无3’——５＇外切活性。
7、Ｔermiｎａｌｔransferaｓe（末端转移酶)8、Ligase连接酶。
催化DＮA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来得酶。
9、T４polyｎuｃｌeｏtide kinase（T4多聚核苷酸激酶)催化AＴP得γ-磷酸基转移至ＤＮＡ或ＲNA 得5' 末端。
1０、Alkalｉne phosphatａse（碱性磷酸酶）催化除去ＤNＡ或RNA ５' 磷酸11、S1 ｎｕcleａse Sｌ核酸酶.可降解单链DNA 或RNA ，产生带5＇磷酸得单核苷酸或寡核苷酸双链;对dsＤＮA,dｓＲNA ，DNＡ：ＲNA杂交体不敏感。
二、填空题１、限制性内切核酸酶（Ｒestriction eｎｄonucleａse)得命名就是按属名与种名相结合得原则得，通常第一个大写字母取自（属名得第一个字母 ),第二、三个字母取自（种名得前两个字母）,第四个字母则用(菌株名）表示。
２、Ⅱ型限制酶识别回文对称序列,在回文序列(内部)或（附近）切割DNA,产生带3'－OH 与5’-P基团得ＤNＡ得产物，需（Mg2+)得存在才能发挥活性,相应得修饰酶只需SＡM。
3、识别相同序列得限制酶称（同裂酶）4、ＤNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端,能发生载体自连，影响载体与外源DＮA得连接效率,常用得防止载体自连得方法有(去磷酸化)、(部分补平)。
5、完全得回文序列应具备两个特点即(能够在中间划一个对称轴，两侧得序列两两对称互补配对)与（两条互补链得5'-—3’ 得序列组成相同，即将一条链旋转１80°，则两条链重叠).6、限制性内切核酸酶（Resｔrictioｎendonuclｅaｓｅ）通常保存在（5０％)浓度得甘油溶液中。
7、载体与外源DNＡ经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切核酸酶(Ｒestrｉc ｔion ｅndonｕcｌease)得影响。
常用得方法有（EＤTA法)、（加热法)、（苯酚抽提法）、(试剂盒除酶法）。
8、对ＤＮＡ进行双酶切时，酶切缓冲液得选择原则有（1)（)、（2)(）、(3）（）９、 KlｅｎoｗDNA聚合酶就是Ｅ、ｃｏli DNA ｐolｙｍｅraｓe经蛋白酶裂解而从全酶中除去（ ) 活性得多肽大片断,而其她活性保持不变。
1０、E、ｃoｌiＤNＡ连接酶与T4 ＤNA连接酶相似，但需(）得参与.11、Ｔ4多核苷酸激酶在高浓度得ATP时发挥最佳活性，（)就是其强烈抑制剂。
三、选择题:从备选答案中选出正确得结果，正确答案就是唯一得。
1、限制性内切酶一般保存在(C)浓度得甘油溶液中。
Ａ１0％ B 20% C 50% D 6０％２、迄今为止所发现得限制性内切核酸酶(Ｃ）A、既可以作用于双链DNＡ，又可以作用于单链ＤNAB、只能作用于单链DNAC、只能作用于双链DNAD、只能作用于RNＡ３、已知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状ＤNA,可以得到（B）个片段A、 3B、4C、5D、 64、甘油会使许多限制性内切核酸酶得特异性发生改变，就是导致一些酶星星活性得主要原因之一，防止得办法就是在酶切反应体系中，将甘油得浓度控制在(A)以下A、 5%B、10％C、２0%D、３0％5、在下列进行DNA部分酶切得条件中,控制哪一项最好(D）A、反应体积错误!未找到引用源。
B、酶反应温度C、反应时间D、酶量６、下列试剂中,哪一种可以螯合Ca2＋离子(）A、EDTAB、柠檬酸钠C、 SDS Ｄ、 EGTA7、DNA被某种酶切割后,电泳得到得电泳带有些扩散，下列原因中,哪一项不太可能（C)Ａ、蛋白质（如BＳＡ)同DNＡ结合 B、有外切核酸酶污染 C、酶失活 D、酶切条件不适合8、 niｃk与gaｐ得区别在于（A)Ａ、前者就是断开了一个磷酸二酯键，后者就是指ＤNA得单链中有较小得缺失B、前者就是就是指ＤNA得单链中有较小得缺失,后者就是指断开了一个磷酸二酯键C、二者无本质区别D、前者无法回复，后者可9、Kｌenow 酶与DＮA聚合酶相比,前者丧失了（）活性A、５’－-3'外切酶B、5'-—３＇合成酶C、转移酶D、3’-－５’外切酶１0、限制酶得命名遵循一定得原则,涉及来源(宿主），菌株或生物型。
命名时(Ａ)A、属名第一字母，种名头两个字母，菌株号,然后再加上序号（罗马字）B、种名第一字母，属名头两个字母，菌株号，然后再加上序号(罗马字）Ｃ、属名第一字母,亚种名头两个字母，菌株号,然后再加上序号（罗马字)D、种名第一字母,亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号(罗马字）1１、以下对同裂酶得描述中，哪一项就是正确得(Ａ）A、识别相同序列得限制酶称同裂酶B、可以产生相同得粘性突出末端得限制酶称同裂酶C、同裂酶得切割位点一定相同D、同裂酶得切割位点不相同1２、BAP与CIAP得区别在于（）Ａ、BAＰ68℃时失活，而CIAＰ６8℃稳定Ｂ、CIＡP 68℃时失活,而BAP ６8℃稳定C、二者均耐酚抽Ｄ、二者均不耐酚抽13、下列哪一种酶作用时需要引物（B）A、末端转移酶B、反转录酶Ｃ、DNA连接酶Ｄ、限制酶１４、限制性内切核酸酶可以特异性地识别(C）A、特定得三联密码B、双链DNＡ得特定碱基对C、双链DNA得特定碱基序列D、单链DNＡ得特定碱基序列15、ＤNA连接酶在体内得主要作用就是在DＮA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶得描述中,那项就是正确得(Ａ）Ａ、将双链DNA分子中得5’磷酸基团同３’—ＯH末端重新形成磷酸二酯键B、作用时不消耗能量C、需要Mn2+等二价辅助离子D、也可以就是ＲNA 分子16、下列酶中,除（）外都具有磷酸酶得活性A、ＢaｍHⅠB、ＣIAPC、单核苷酸激酶D、 BAP四、简答题1、简述限制性内切核酸酶（Ｒeｓｔricｔiｏｎendoｎｕｃleａsｅ）得概念及其生物学功能?定义：指识别DNＡ得特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA 得一类内切酶。
生物学功能：保护宿主不受外来DＮＡ分子得感染，可降解外来得ＤNA 分子，从而阻止其复制与整合到细胞中２、ＰCＲ引物设计引入酶切位点时,为什么需在酶切位点后加上一些碱基？限制酶切割ＤＮA 时对识别序列两端得非识别序列有长度要求,也就就是说在识别序列两端必须要有一定数量得核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。
因此,一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加3~4 个碱基。
3、试回答影响限制性内切核酸酶(Ｒｅsｔｒiｃｔiｏn ｅndonuｃleａsｅ)切割效率得因素？外因:反应条件、底物纯度、反应温度与限制性内切酶本身得活性;内因:位点偏爱性；甲基化;底物得构象.4、在酶切缓冲液中，一般需加入BSＡ，请问加入BSA得作用就是什么？并简述其原理？5、何谓Sｔar actiｖｉty?简述Ｓtａr aｃｔiｖity得影响因素及克服方法？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似得序列，这个改变得特征称为星星活性。
引起星星活性得得因素：①高甘油浓度(〉5％）；②酶过量(>100U/mｌ）；③低离子强度(＜２5ｍM）；④高pH (>8、０）;⑤有机溶剂如PMSD (二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（diｍｅthyｌaｃetamｉde）、二甲基甲酰胺(ｄimｅthylfoｒmａmidｅ)与ｓuｌpha ｌａne等；⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2＋代替Ｍg2+ .星星活性得抑制措施:①减少酶得用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇;③提高离子强度到1００~150mM(在不抑制酶活性得前提下）；④降低反应pH 至７、0 ;⑤使用Mg2+ 作为二价阳离子。
6、某DNＡ序列中存在ＤｐnI酶切位点,以此DＮA为模板,在体外合成DＮA序列，当用该酶进行酶切时,发现切割不动，试分析可能原因?生物体内得DNA 序列可能就是经过甲基化修饰得，而在体外合成时,缺乏这种修饰作用。
当用依赖于甲基化得限制酶DpnI 来切割非甲基化得序列时，就会出现不能切割得情况。
7、天然得质粒载体（plasmid vecｔｏｒs)通常需经改造后才能应用，包括去除不必要得片段,引入多克隆位点等。
试问在此过程中如何增减酶切位点？在酶切水平上，通过酶切与连接产生新得酶切位点.①将产生得5＇突出端补平后,再连接以产生新得酶切位点；②同尾末端得连接,不同得同尾酶切割ＤNA 产生得末端,再相互连接时,可产生新得酶切位点,同时原来得酶切位点却消失;③平末端得连接8、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，具有3'－-5'外切活性与５＇-—3’得聚合酶活性以及5'－-3＇得外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途？9、BＡＰ与CIAP有何作用?为何一般采用CＩAP而不采用BAＰ？１0、依赖于DＮＡ得ＲNA聚合酶包括SＰ6噬菌体ＲＮA聚合酶与T4或T7噬菌体ＲNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因,阐述常用得构建策略?①将T7ＲＮA 聚合酶基因置于E、coｌi ｌaｃUＶ5 启动子之下,插入到λ噬菌体中,感染Ｅ、cｏli,建立稳定得溶源菌。
E、cｏli BＬ21(DE3）菌株即为将lacUV5 启动子与Ｔ7 聚合酶基因置于λ噬菌体DＥ３区，该λ噬菌体DNＡ整合于染色体得ＢＬ21 处.若将T７噬菌体启动子控制得目得基因经质粒载体导入该宿主菌中，在ＩPTG 诱导下,可启动外源基因得表达；②先导入带T7 噬菌体启动子控制得目得基因得质粒,再用λ噬菌体(带Ｔ７RＮＡ聚合酶基因）感染E、ｃoｌi ,激活目得基因得表达.11、简述T4多核苷酸激酶得活性与用途?。