PCR 技术
基本原理 (PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应) 一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子DNA 扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的 核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 。
反应体系 DNA模板；dNTPs；+Tris·HCl缓冲液；引物；DNA聚 合酶
基因的分类：结构基因 调控基因
原核生物基因结构
—— 操纵子(operon) 机制
启动序列 (promoter)
编码序列
其他调节序列
操纵序列 (operator)
真核生物基因结构
真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区， 而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔 序列，即内含子（intron），编码区则成为外 显子（exon）。
实时荧光定量PCR （Real-time PCR）
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针 为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光 基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链 ，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。
2.3 中心法则与基因表达调控
2.4 自然界的基因转移和重组
2.1 核酸的结构与功能
核酸：就是由许多核苷酸按照一定的顺序连接 所组成的多核苷酸，它的主要功能是充当遗传 信息的载体。
脱氧核糖核酸: DNA
戊糖
碱基
核苷酸的基本组成
DNA的结构和功能
DNA的一级结构与功能
结构式
DNA的二级结构与功能
1 螺旋直径2nm 2 链间有螺旋形凹槽，较 小的为小沟（1.2 nm）， 较大的为大沟（2.2nm） 3 碱基间距为0.34nm 4 结构重复周期3.4nm 5 每轮碱基数为10 6 碱基平面与纵轴垂直。
RNA的结构与功能
信使RNA（messenger RNA，mRNA） 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）
lacZ
lacY
lacA
DNA
mRNA
The LAC operon
Protein
β -Galactosidase
Permease
Transacetylase
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②CAP正调控
真核生物基因的表达调控
DNA水平的调控
转录水平的调控 (transcriptional regulation) 转录后水平的调控 (post transcriptional regulation) 翻译水平的调控 (translational regulation) 翻译后水平的调控 (protein maturation)
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种， 以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
定量PCR（Q-PCR）还有半定量semi quantitative PCR。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是 在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅 DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
DNA单链之间、一条DNA和一条RNA链 之间主要存在序列互补配对区域，不管 是整条链互补，还是部分序列互补，均 可能重新形成整条双链或部分双链，这 即为核酸分子杂交（hybridization）。
2基.2因基的因结与构基因组
基因（gene）：能够编码一段多肽或功能RNA 的一段核苷酸序列。
基因的基本特性：基因可自我复制 基因决定性状 基因可以突变
基因工程的基本原理
A 重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA
分子遗传学 1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接
蛋白质的生物合成
• 氨基酸活化
肽链的起始 •
肽链的延伸 • 肽链的终止
• 新合成多肽链的折叠和加工
2.3.2 基因的表达调控
转录水平上的调控 mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控
原核生物基因的表达调控
调节基因 调控基因
①阻遏蛋白的负调控 结构基因
lacI
PlacI
Plac Olac
主要用于mRNA的PCR扩增
5'
5'
5' 3'
5' 3'
3' 5'
CC..C 3' 限 制 酶 3'GG..G 识别序列
AAA...A 3' mRNA
引物1 RT RNaseH
限制酶 AAA...A 3' 识 别 序 列 3 'T T T . . . T
5' AAA...A 3' TTT...T
5'
AAA...A 3' TTT...T
5'
TTT...T
TdT + dGTP
5'
TTT...T
RT
5'
5'
3'
3'
5'
RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转 录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。
DNA变性
核酸的理化性质
在某些理化因素下，DNA分子互补碱基之间的氢键断 裂，致使DNA双螺旋结构松开，变成单链，即为DNA变性 （denaturation）。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿 素、甲醛等。
核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效 应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量DNA变 性的程度。
基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产 ——生化工程学原理
基因工程的基本原理
D 基因工程的支撑技术
核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术
第二节 基因工程的分子生物学基础
2.1 核酸的结构与功能 2.2 基因与基因组
DNaseI超敏感位点 基因座控制区（LCR） 核基质结合区（MAR）
真核生物基因表达调控的特点和种类
真核生物DNA水平上的基因表达调控
真核生物转录水平上的基因表达调控
顺式作用元件和反式作用因子
真核基因他水平上的调控
染色质结构与调控 基因丢失 基因扩增 基因重排 DNA甲基化状态与调控
RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控
终止子（terminator）基因结构中能够促进转 录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的
终止子序列形成茎环结构而终止。Fra bibliotek基因组
基因组（genome）：单倍体细胞中的全套染色体 上所有基因的总和。
原核生物的基因组
基因组小 多顺反子mRNA 非编码区少 基因重叠 不含内含子
真核生物基因组
转运RNA（transfer RNA，tRNA）
mRNA
1. mRNA的转录和翻译发生在 同一个细胞空间，这两个过程 几乎是同步进行的 。 2. 半衰期短。 3. 许多原核生物mRNA以多顺 反子的形式存在。 4.原核生物mRNA的5’端无帽子 结构，3’端没有或只有较短的 多聚（A）结构。 5. 原核生物常以AUG（有时 GUG，甚至UUG）作为起始密 码子
5S rRNA 36种蛋白质
高等动物核糖体（80S）
40S亚基
60S亚基
18S rRNA 33种蛋白质
28S rRNA
5.8S rRNA 49种蛋白质 5S rRNA
tRNA
二级结构
三级结构
核酸的理化性质及其应用
一般理化性质
DNA为白色纤维状固体 RNA为白色粉末状固体 紫外吸收：260nm A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
• 真核细胞mRNA的合成和功 能表达发生在不同的空间和时 间范畴内。 • 单顺反子形式存在。 • 5’端存在“帽子”结构。 • 绝大多数具有多聚(A)尾巴。 • 真核生物几乎永远以AUG作 为起始密码子。
rRNA
E.coli核糖体（70S）
30S亚基
50S亚基
16s rRNA 21种蛋白质
23S rRNA
基因工程
基因工程的基本原理
B 基因的分子生物学
基因工程的基本原理
C 基因工程的基本原理
提高外源基因的剂量——分子遗传学原理 筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、
增强子、操作子、终止子、上游调控序列等 ——分子生物学原理
修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序 列、mRNA非编码区、密码子等 ——分子生物学原理
2接.4合自作然用界的基因转移和重组
细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒便可从一 个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转 移称为接合作用（conjugation） 。
转化及转导
转化作用（transfromation）
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞 或培养的受体细胞获得新的遗传表型。