《质谱法》学习报告摘要质谱（分析）法作为近代科学一种重要的分析方法正在越来越多的领域彰显它不可或缺的地位。

而在近几十年生命科学也开始蓬勃发展。

二者就此发生了融合，互相影响。

本文在简介质谱（分析）法的同时，重点阐述其在生命科学领域的重要作用。

关键词质谱法原理、装置、操作、质谱法与生命科学一、质谱法的原理质谱（分析）法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。

主要利用电磁学原理，使带电样品的离子按质合比进行分离。

具体过程为：离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及所带电荷数有关。

具有不同速率的带电粒子进入质谱分析仪器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按质合比进行分离。

[1]二、质谱法采用的仪器1.原理利用运动离子在电场和磁场中偏转原理设计，用于进行质谱分析的仪器称为质谱计或质谱仪。

前者指用电子学方法检测离子，而后者指离子被聚焦在照相底板上进行检测。

质谱仪可以分成三个部分：离子化器、质量分析器与侦测器。

其基本原理是使试样中的成分在离子化器中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。

在质量分析器中，再利用电场或磁场使不同质荷比的离子在空间上或时间上分离，或是透过过滤的方式，将它们分别聚焦到侦测器而得到质谱图，从而获得质量与浓度(或分压)相关的图谱。

2.分类[2]（1）分类标准：应用角度①有机质谱仪（用途最广）气相色谱-质谱联用仪液相色谱-质谱联用仪其他有机质谱仪，主要有：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪，傅立叶变换质谱仪②无机质谱仪火花源双聚焦质谱仪。

电感耦合等离子体质谱仪二次离子质谱仪辉光放电质谱仪③生物质谱分析生物质谱分析（Biological mass spectrometry）是以质谱分析技术用于精确测量生物大分子，如蛋白质，核苷酸和糖类等的分子量，并提供分子结构信息。

对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析。

一般的方法有：电喷雾电离质谱，基质辅助激光解吸电离质谱，快原子轰击质谱，离子喷雾电离质谱，大气压电离质谱。

可对分子量高达几十万的生物大分子进行快速（几分钟一个样品）、精确（ 0.01%）和高灵敏度（10-15mol）的测定。

质谱仪由工作原理的不同可区分如下：（2分类标准：电离方式电子碰撞质谱化学电离质谱光电离质谱阈值电离质谱（3）分类标准：质量分析方式从质谱仪所用的质量分析器的不同，把质谱仪分为双聚焦质谱仪、四极杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换质谱仪等。

三、质谱仪的操作1.无机质谱法：首先原子化；其次将原子化的大部分转化为离子流，一般为单电荷正离子；然后将离子按质量——电荷比分离；最后计算各种离子的数目或测定由试样形成的离子轰击传感器时产生的离子电流。

2.有机质谱法：采用质谱法的手段获得无机、有机和生物分子的结构信息，并对复杂化合物的各组分进行定性与定量分析。

通常采用高能粒子束（如：电子、原子、离子）等使已气化的分子离子化，或将固态或液态试样直接转变成气态离子，让分解出的阳离子加速导入质量分析器中，然后按照质荷比的大小顺序进行收集和记录。

根据质谱图中出峰的位置，可以进行定性和结构分析；根据峰的强度，可以进行定量分析。

四、质谱法的应用（一）质谱法的传统应用[3]1.相对分子量的测定除同位素峰外，分子离子峰应出现在谱图中的最高质量位置。

但当分子离子不稳定时，可能导致分子离子峰不在谱图中出现，或生成大于或小于分子离子质量的峰。

2.分子式的测定分子式测定可采用同位素丰度法，但此时对分子量大或结构复杂、不稳定的化合物是不适用的。

现在一般都采用高分辨质谱法测定，可直接显示可能分子式及可能率。

若测出的分子量数据与按推荐的分子式计算出的分子量数据相差很小，则可认为推测是可信的。

（二）质谱在生命科学研究中的应用概述在80年代中期研发出的的两种新的电离技术：电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）和基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI）带来了质谱法应用真正意义上的变革，这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol （10-12）乃至fmol（10-15）水平检测分子量高达几十万的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学一个崭新的领域——生物质谱，促使质谱技术在生命科学领域获得广泛应用和发展。

1.柱前衍生高效液相色谱·质谱法测定血浆中的氨基葡萄糖浓度[4]该方法以氨基半乳糖为内标，用丙酮沉淀蛋白后，加入5μL三乙胺和lOμL 异硫氰酸苯脂后，在60℃的恒温水浴中反应1h，用氮气吹干、流动相溶解后于离心机上以12000r／rain离心5rain后进样20μL分析；以甲醇与水作流动相，经过Ultimate.XBC柱(4.6mm×250mm，5μm，WelchMaterials)在梯度模18式下分离后1：4分流，以0.2mlVmin的流速进质谱分析.实验结果表明：氨基葡萄糖的回归方程为Y=6.70×10-4X+1.1l×10-2(r2=0.996)，在0.10—5.00μg/mL 范围内线性关系良好；最低定量限为0.10mg/L；氨基葡萄糖和内标的萃取回收率分别为88.3％一92.1％和85.2％；日内、13间精密度的RSD值分别为<6.0％、<5.O％，稳定性的RSD<7.5％。

所建立的方法准确度好、灵敏度高、稳定性好，适合于血浆中的氨基葡萄糖的含量测定。

2．蛋白质和多肽的分析[5]（1）分子量测定分子量是蛋白质、多肽最基本的物理参数之一，是蛋白质、多肽识别与鉴定中首先需要测定的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。

分子量正确与否往往代表着所测定的蛋白质结构正确与否或者意味着一个新蛋白质的发现。

生物质谱可测定生物大分子分子量高达400,000Da，准确度高达0.1%-0.001%，远远高于目前常规应用的SDS电泳技术与高效凝胶色谱技术。

生物质谱配以响应的软件还可实现对组合化学多肽产物的快速测定。

（2）肽谱测定（Peptide Mapping）肽谱是基因工程重组蛋白结构确认的重要指标，也是蛋白质组研究中大规模蛋白质识别和新蛋白质发现的重要手段。

生物质谱可测定肽质量指纹谱，并给出全部肽段的准确分子量，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选。

（3）肽序列测定技术①肽序列标签技术（peptide sequence tags）构成蛋白质的常见氨基酸有20种，一段3个氨基酸的肽段碎片将有8,000种可能的排列方式，4个氨基酸将有160,000种排列方式，即一个特定的4个氨基酸序列的出现概率为1/160，000。

因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。

生物质谱技术中的串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列，将串联质谱产生的肽段序列用于数据库查寻，称之为肽序列标签技术，目前广泛应用于蛋白质组研究中的大规模筛选。

较之传统的Edman降解末端测序技术，生物质谱具有不受末端封闭的限制，灵敏度高，速度快的特点。

②肽阶梯序列技术(peptide ladder sequencing)采用不同浓度的蛋白酶分别降解同一蛋白或多肽，产生长短不等的一组多肽样品，根据质谱测定的肽段质量间的差异推导出多肽的序列。

（4）疏基和二硫键定位二硫键在维持蛋白和多肽三级结构和正确折叠中具有重要作用，同时也是研究翻译后修饰所经常面临的问题，自由疏基在研究亚基之间及蛋白与其它物质相互作用中具有重要意义。

将生物质谱技术中的串联质谱技术与蛋白酶切、肽谱技术相结合，可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定。

在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。

3.傅里叶变换·离子回旋共振质谱法在蛋白质翻译后修饰研究中的应用[6]蛋白质翻译后修饰几乎参与了细胞所有的正常生命活动，并发挥十分重要的调控作用，目前已成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域。

常见的蛋白质翻译后修饰包括类泛素化、乙酰化、磷酸化、甲基化、糖基化等。

傅里叶变换·离子回旋共振质谱(FT·ICRMS)具有超高分辨率、高质量测量准确度、质量范围宽、速度快、性能可靠等显著优点，在确定蛋白质翻译后修饰位置以及修饰的结构研究方面具有独特优势。

4.寡核苷酸和核酸的分析[7]人类基因组有30亿个碱基，但真正与疾病有关的只是少数可变的基因。

基因库中有一个很丰富的资源是300万个单核苷酸多态性片段（SNPs），它们可以作为药物基因组学中基因型和表型的纽带。

SNPs不一定要准确定位，关键是测定其在种群中出现的频率及其遗传和表型的关系，这便需要大规模的测序技术。

Griffin T.J.等用浸染剪切分析（一种不经PCR而可以直接进行SNPs分析的信号放大方法）结合MALDI-TOF-MS分析人基因组SNPs，该法节省时间，又适于高通量分析，有利于特异性基因的定位、鉴定和功能表征。

DNA在内环境中的温度、pH、机体代谢过程产生的超氧化物自由基，外环境中的各种化学物质（如烷化剂）、物理因素（紫外线等）各种条件作用下，都可能发生损伤，若损伤不能及时修复，就会产生严重的生物学后果，各种条件下DNA损伤的质谱研究多有报道。

采用MALDI-TOF/MS已经实现对数十个碱基寡核苷酸的分子量和序列测定。

此技术可用于天然或人工合成寡核苷酸的质量控制。

5..药物代谢[8]近年来质谱在药物代谢方面的研究进展迅速。

其主要研究药物在体内过程中发生的变化，阐明药物作用的部位、强弱、时效及毒副作用，从而为药物设计、合理用药提供实验和理论基础。

特别是采用生物技术获得的大分子药物的体内代谢研究，更是传统的研究手段难以解决的难题。

体内药物或代谢物浓度一般很低，而且很多情况下需要实时检测，而质谱的高灵敏度和高分辨率以及快速检测则为代谢物鉴定提供了保证。

LC-ESI-MS-MS在这方面有独特的优势。

由于对液态样品和混合样品的分离能力高，可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构，LC-ESI-MS-MS已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定、复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等。

6.质谱法在抗肿瘤靶点蛋白的外源性化学修饰研究中的应用[9]研究证明：某些具有迈克尔反应活性的化合物对于肿瘤细胞中靶点蛋白作用的化学生物学物质基础通常源于其对后者进行的化学共价修饰，从而破坏了后者正常的生物学功能并且诱导肿瘤细胞死亡。

鉴于质谱法已成为研究化学小分子与生物分子共价修饰作用的一种主流手段。