紫花苜蓿ＭｓＺＩＰ基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测李燕１，孙彦２，杨青川１＊，康俊梅１，张铁军１，房锋３（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；２．中国农业大学动物科技学院，北京１００１９１；３．中国农业科学院植物保护研究所，北京１００１９３）摘要：根据已经克隆得到的ＭｓＺＩＰ基因（ＧｅｎＢａｎｋ序列号：ＨＱ９１１７７８），扩增编码区ｃＤＮＡ，构建植物超表达载体ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ。

酶切鉴定表明，目的基因已经正确的插入到载体中，超表达载体构建成功。

采用ＣａＣｌ２冻融法将其转入农杆菌菌株中，然后采用农杆菌介导的方法，转化紫花苜蓿，共得到１１株抗性苗，对其中的４株进行卡那霉素基因ＰＣＲ检测，均得到了目的条带。

同时对这４株抗性苗进行目的基因的ＲＴ－ＰＣＲ检测，均得到了目的条带。

说明ＭｓＺＩＰ基因已经成功在苜蓿中超表达。

为了进一步验证该基因的功能，分别用２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ和２５μｍｏｌ／ＬＰＥＧ－６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后进行生理指标的测定。

结果表明，ＭｓＺＩＰ基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的耐盐性和耐旱性。

关键词：紫花苜蓿；ＭｓＺＩＰ基因；超表达载体；苜蓿转化；转基因苜蓿检测中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－５７５９（２０１２）０６－０１８２－０８＊ 随着生物技术的发展，对于植物的研究已经深入到分子水平，侧重于从分子角度阐明植物各种生理反应机理，分子机制，以及基因水平的调控。

在培育植物新品种，提高植物抗逆性方面，植物转基因技术已经成为近年来研究的重点内容之一。

转基因育种也成为了苜蓿新品种培育的一项重要手段［１］。

在目前的植物转基因育种中，主要采用的技术有农杆菌介导法，微注射法，电击法和基因枪法。

在紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）的育种工作中，农杆菌介导法成为主要的方法，１９８６年，首例农杆菌介导的苜蓿转化获得成功，之后又建立了紫花苜蓿的遗传转化体系［２，３］，苜蓿转基因工作获得了很大的进展。

在苜蓿中，已经有很多抗逆相关的基因被分离，Ｂｒｏｕｗｅｒ等［４］将烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）的Ｍｎ－ＳＯＤ　ｃＤＮＡ导入苜蓿中，发现转基因植物ＳＯＤ活性增强，２轮的田间试验鉴定表明，转基因苜蓿的抗寒性明显提高。

２０００年Ｗｉｎｉｃｏｖ和Ｂａｓｔｏｌｄ［５］将Ａｌｆｉｎｌ基因导入苜蓿中，增强了盐诱导的ＭｓＰＲＰ２基因的表达，在植株的生长过程中其耐盐性得到了提高，并且生长速度加快。

Ｍｕｎｎｉｋ等［６］从紫花苜蓿中分离出了ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）路径第一个关键酶基因ＳＩＭＫ，序列分析结果表明，它与拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）中的ＭＡＰＫ基因具有极大的相似性，盐胁迫下其体内的表达水平上调。

２０１１年，江藤等［７］对蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）全基因组ＷＲＫＹ转录因子进行了分析，发现蒺藜苜蓿中含有２８个ＷＲＫＹ基因，同时将这些基因与水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）的ＷＲＫＹ基因进行了比较分析，为研究苜蓿的ＷＲＫＹ转录因子提供了重要的理论依据。

刘晓静等［８］将抗冻基因ＣＢＦ２构建表达载体并转化和田苜蓿，成功得到和田苜蓿的愈伤组织。

燕丽萍等［９］采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转ＢＡＤＨ基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究，结果表明，转入的ＢＡＤＨ基因可以稳定遗传，转基因苜蓿耐盐性明显高于对照。

蒋世翠等［１０］将αＦＧＦ基因构建表达载体并转化紫花苜蓿，成功得到了表达αＦＧＦ基因的苜蓿，为苜蓿作为植物生物反应器奠定了理论基础。

紫花苜蓿是分布最广的一种牧草，它的适应性很强，是世界上种植面积最广的一种牧草。

但是干旱胁迫和高盐胁迫却是影响苜蓿生长的主要因素，为了从分子机理上解决这一问题，越来越多的盐诱导基因已经从苜蓿中分１８２－１８９２０１２年１２月 草　业　学　报 ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ 第２１卷　第６期Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６＊收稿日期：２０１１－１２－０５；改回日期：２０１２－０１－１１基金项目：“十二五＂国家科技支撑计划课题（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１－０１－３）和中央级公益性科研院所专项资金项目（２０１１ｃｊ－１４）资助。

作者简介：李燕（１９８４－），女，蒙古族，内蒙古乌兰察布人，博士。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａａｓｌｉｙａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＊通讯作者。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｃｈｙａｎｇ６６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ离出来，在烟草中超表达可以增强烟草的耐盐性［１１，１２］。

Ｄｅｕｔｃｈ和Ｗｉｎｉｃｏｖ［１３］从耐盐苜蓿ｃＤＮＡ文库筛选到一个新ｃＤＮＡ克隆，称作ＭＳＰＲＰ２９基因，研究表明该基因与紫花苜蓿富含脯氨酸的细胞壁蛋白转录后盐调节表达有关，能够通过提高耐盐苜蓿中的脯氨酸含量来提高苜蓿的耐盐性。

Ｂｏｒｓｉｃｓ和Ｌａｄｏｓ［１４］用差异显示法从菟丝子（Ｃｕｓｃｕｔａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）侵染的紫花苜蓿中克隆出一个与钙调蛋白相关的基因ＰＰＲＧｌ，在高盐、渗透、低温以及ＡＢＡ处理下，ＰＰＲＧｌ转录水平快速上调。

Ｇｉｎｚｂｅｒｇ等［１５］从盐胁迫的紫花苜蓿根ｃＤＮＡ文库中成功克隆出２个编码Ｐｒｏ关键的合成酶基因ｃＤＮＡ克隆，ＭｓＰ５ＣＳ－１和ＭｓＰ５ＣＳ－２，两者的转录水平在盐胁迫下显著增加。

本实验室从耐盐苜蓿中克隆得到的锌指蛋白基因ＭｓＺＦＮ，在盐诱导下，表达量也显著升高［１６］。

本试验构建植物超表达载体ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ，并采用农杆菌介导的方法将目的基因ＭｓＺＩＰ转入苜蓿中。

成功获得了转基因苜蓿苗，其后的生理指标检测表明，在苜蓿中超表达ＭｓＺＩＰ基因，可以提高苜蓿的耐盐性，为研究该基因的功能以及苜蓿新品种的选育提供依据。

１　材料与方法１．１　试验材料耐盐品种紫花苜蓿中苜１号由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成，本实验室保存种子。

本试验于２０１１年进行。

选取饱满健康的种子用７５％乙醇灭菌１０ｍｉｎ，０．１％升汞灭菌７ｍｉｎ后，无菌水洗净，放置在１／２ＭＳ固体培养基上，于２５℃培养箱培养。

克隆载体ＰＭＤ１８－Ｔ，实验所需的各种限制性内切酶和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｔａｋａｒａ公司，用于构建超表达载体的原始质粒ＰＢＩ１２１和农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４由本实验室保存。

大肠杆菌感受态ＤＨ５α购自北京全式金生物技术公司。

质粒小提试剂盒，胶回收试剂盒，Ｔｒｉｚｏｌ购自北京博迈德生物公司。

其他生化试剂均购自北京康博顺达生物有限公司。

１．２　ＭｓＺＩＰ编码区ｃＤＮＡ的获得根据已经得到的ＭｓＺＩＰ基因序列，设计１对带有酶切位点的引物：ＭＦ：５′－ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＧＡＣＴＡＡＧ－ＧＡＧ－３′；ＭＲ：５′－ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣ－３′。

酶切位点用下划线表示，分别为ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ。

提取紫花苜蓿总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ作为模板，进行ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析后，切胶回收，连接到克隆载体ＰＭＤ１８－Ｔ上，命名为ＰＭＤ－ＭｓＺＩＰ，转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，菌体ＰＣＲ检测之后，将含有目的条带的阳性克隆送到北京华大基因生物技术有限公司测序。

１．３　超表达载体的构建选取测序完全正确的阳性菌提取质粒，用限制性内切酶ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切质粒ＰＭＤ－ＭｓＺＩＰ和ＰＢＩ１２１，琼脂糖凝胶检测后各自回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶，１６℃连接６ｈ。

连接好的载体命名为ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ，转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，ＰＣＲ检测后送阳性克隆测序。

将含有阳性克隆的菌落，提取质粒，ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切鉴定。

１．４　转基因苜蓿的获得将构建好的超表达载体采用ＣａＣｌ２冻融法转入农杆菌中，用于苜蓿的转化。

苜蓿种子灭菌后播种在无菌１／２ＭＳ培养基，２５℃培养箱中培养７ｄ后，切下子叶，转入预培养培养基（２，４－Ｄ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　０．２５ｍｇ／Ｌ＋ＵＭ）中培养２ｄ后，将子叶浸泡在ＯＤ６００＝０．５的农杆菌转化菌液中１０ｍｉｎ。

取出后吸干菌液，摆放在共培养培养基上（２，４－Ｄ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　０．２５ｍｇ／Ｌ＋ＵＭ），黑暗培养４８ｈ。

之后转入诱芽培养基（５０ｍｇ／Ｌ　Ｋａｎ＋３００ｍｇ／Ｌ　Ｃｅｆ＋２．０ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋ＫＴ　０．２５ｍｇ／Ｌ＋ＵＭ），直至形成愈伤组织，出现再生芽。

当再生芽长至１ｃｍ左右时，将芽切下，转入１／２ＭＳ培养基中生根培养。

当再生苜蓿苗根长至１０ｃｍ，地上部分长至１０ｃｍ左右时，转入营养土中，温室中继续培养。

１．５　再生植株的检测设计１对载体ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ上的引物ＮＰＴ１：５′－ＡＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧ－３′和ＮＰＴ２：５′－ＣＴ－ＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴ－３′，用于扩增卡那霉素抗性基因ＮＰＴⅡ。

实验室改进的ＣＴＡＢ法［１７］提取转基因抗性苜蓿苗的基因组ＤＮＡ作模板，质粒ＰＢＩ１２１和未转基因苜蓿ＤＮＡ分别作为阳性和阴性对照，进行ＰＣＲ扩增。

３８１第２１卷第６期草业学报２０１２年ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析。

以ＭＦ和ＭＲ为引物，用于扩增目的基因。

Ｔｒｉｚｏｌ法提取转基因抗性苜蓿苗的总ＲＮＡ（参见说明书），反转录产物作为模板，质粒ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ和ＰＢＩ１２１分别为阳性对照和阴性对照，进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析。

分别用２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ和２５μｍｏｌ／Ｌ　ＰＥＧ－６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后测量可溶性蛋白含量，可溶性糖含量，相对含水量，丙二醛含量以及脯氨酸含量［１８］。

每个样品都做３次重复，测量结果用ＳＡＳ　９．０数据分析软件在Ｐ＜０．０５水平进行统计分析。

２　结果与分析２．１　ＭｓＺＩＰ基因ｃＤＮＡ序列的获得以紫花苜蓿总ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为模板，ＭＦ和ＭＲ为引物，进行ＰＣＲ扩增。

得到１条长约１　０００ｂｐ的条带（图１）。

将ＰＣＲ产物切胶回收后，连接到载体ＰＭＤ１８－Ｔ上，转化大肠杆菌，将ＰＣＲ鉴定的阳性克隆测序，结果表明序列正确无误，没有碱基突变和移码突变，成功的克隆得到ＭｓＺＩＰ基因。

２．２　超表达载体ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ构建提取构建好的质粒ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ，用限制性内切酶ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳得到１条约１　０００ｂｐ的条带（图２），与预期大小相符，表明植物超表达载体ＰＢＩ－ＭｓＺＩＰ构建成功。

图１　ＭｓＺＩＰ编码区ｃＤＮＡ的克隆Ｆｉｇ．１　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＭｓＺＩＰＭ：ＤＮＡ标记ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ａ：目的片段Ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ．图２　超表达载体的酶切鉴定Ｆｉｇ．２　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｖｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｖｅｃｔｏｒｓＭ：ＤＮＡ标记ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ｐ：ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切后的质粒Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＸｂａＩ　ａｎｄ　ＢａｍＨＩ．２．３　紫花苜蓿再生植株转化经过农杆菌转化的苜蓿子叶，在诱芽培养基上生长３０ｄ后，形成愈伤组织（图３Ａ），继续培养６０ｄ之后，可见在愈伤组织上出现绿色的出芽点，开始形成再生芽（图３Ｂ），当再生芽长到１ｃｍ左右时，将再生芽切下，转入生根培养基中培养（图３Ｃ），再生植株成苗后，根长１０ｃｍ，地上部分１０ｃｍ左右时（图３Ｄ），即可转入营养土中，在温室中继续培养（图３Ｅ）。