第五章
植物检验检疫技术Biblioteka • 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 8、噬菌体检验法
• 噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细 胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在 液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄 清，在固体平板上培养时，则出现许多边 缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为 “噬菌斑”，肉眼即可分辩。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
萌芽法检验 沙土萌发检验 土内萌发检验 试管幼苗症状测定
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 10、诱捕器诱集检验
信息素 诱饵
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 8、噬菌体检验法
国内已采用噬菌体法检查水稻稻种是否带有 白叶枯病菌。病田稻种的稻壳中通常都带 有专化性的噬菌体或存活细菌，可据以确 定稻种确系带菌。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 8、噬菌体检验法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 一、现场检验检疫技术 • 3、软X光透视检测 • 4、检疫犬检查
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 1、相对密度检验 • 一定浓度的食盐水或其它溶液
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 2、染色检验法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
保湿培养检验 吸水纸检验法 通常用底部铺有三层吸水纸的塑料培养皿或其它适 用容器作培养床。先用蒸馏水湿润吸水纸，将种 子按适当距离排列在吸水纸上，再在一定条件下 培养，对多数病原真菌，适宜的培养温度为 20— 25℃，每天用近紫外光 (NUV) 灯或日光灯照明 12h 。
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• 第二节 植物检验检疫新技术的应 用 • 一、核酸杂交技术 • 二、限制性片断长度多态性标记技术 （RFLP）
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第二节 植物检验检疫新技术的应用 三、聚合酶链式反应（PCR） 1、免疫PCR技术 2、反转录PCR检测技术 3、巢式PCR 4、多重PCR 5、实时荧光PCR
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 4、洗涤检验法
洗涤检验的操作程序如下： (3)镜检计数：弃去离心管内的上清液，加入一定量 蒸馏水或其它浮载液，重新悬浮沉集在离心管底 部孢子，取悬浮液，滴加在血球计数板上，用高 倍显微镜检查孢子种类并计数，据此可计算出种 子的带菌量。 (4)孢子生活力测定：用常规孢子萌发测定法、分离 培养法或红四氯唑(TTC)染色法判定孢子死活。
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 11、鉴别寄主检测
应用于植物病毒的鉴定、诊断及检疫中
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 12、植物病原线虫的各种分离方法
漏斗分离法：此法适于分离少量植物材料中有活动能力的线 虫。基本装置是一个直径适当的漏斗，漏斗颈末端接一段 乳胶管，用弹簧夹把管子夹住。漏斗放置在支架上，其内 盛满清水。把检验的植物材料洗掉泥土后，切成0．5cm长 的小段，放在纱布中包起来，轻轻地浸入漏斗内。线虫从 植物组织中逸出，经纱布沉落到漏斗颈底，经 12h或过一 夜后，打开弹簧夹使胶管前端的水流到玻皿内，镜检线虫
取10g稻种，脱下谷壳剪碎或磨碎，放入已灭 菌处理的烧杯中，加灭菌水20ml浸泡30min， 过滤后分别吸取滤液1.5、1.0和0.5ml，置 于三个灭菌的培养皿内
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 8、噬菌体检验法
各加 lml 新培养的白叶枯细菌指示菌液 ( 浓度 为9X108／ml以上)混匀后加入10ml融化的肉 汁胨琼脂培养基，摇匀凝成平板后，放在 25—28℃温箱中，培养10—12h
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 4、洗涤检验法
用于检测种子表面附着的真菌孢子，包括黑 粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌 的夏孢子以及多种半知菌的分生孢子等。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 4、洗涤检验法
洗涤检验的操作程序如下： (1)洗脱孢子：将一定数量的种子样品放人容器内并 加入定量蒸馏水或其它洗涤液，振荡 5 一 lOmin ， 使孢子脱离种子，转移到洗涤液中。 (2)离心富集：将孢子洗涤液移人离心管，低速离心 (2500—3000r／min)10—15min，使孢子沉集在离 心管底部。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
保湿培养检验 吸水纸检验法 培养7 一 l0d 后检查和记载种子带菌情况，检查时， 用两侧照明的实体显微镜逐粒种子检查。本法依 据种子上真菌菌落的整个形象，即“吸水纸鉴别 特征”来区分真菌种类。检查时应特别注意观察 种子上菌丝体的颜色、疏密程度和生长特点、真 菌繁殖结构的类型和特征
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
保湿培养检验 冰冻吸水纸法 是前一个的改进版，可以减少杂菌污染、抑 制种子发芽
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
保湿培养检验 琼脂平皿法 用琼脂培养基代替了吸水纸
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 5、分离培养检验
主要适用于潜伏于种子、苗木、繁殖材料及 植物产品内的病原菌 分离真菌一般用PDA培养基，分离培养细菌用 牛肉汁培养基，对于特殊要求的菌类可以 用选择性培养基
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 5、分离培养检验
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 12、植物病原线虫的各种分离方法
浅盘分离法：原理同漏斗法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 12、植物病原线虫的各种分离方法
简易漂浮分离法：本法利用干燥的线虫胞囊 能漂浮在水面的特性分离土壤中的马铃薯 金 线 虫 (Globoderarostochiensis) 和 各 种 胞囊线虫(Heterodera)。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 一、现场检验检疫技术 • 2、过筛检验：将需用的筛层，按筛孔大小顺序
套好(小筛孔放在下面)，将样品放人上层选筛内 (不宜过多，约达筛层高度的2／3)，套上筛盖， 电动或手动回旋转动一定时间后，按筛层将筛上 物和筛下物分别倒入白瓷盘中，用扩大镜或解剖 镜检查，检出昆虫和螨类，同时还可检出虫粒、 病粒、杂草籽和其它夹杂物。若检查时室温低于 10℃，最下层筛出物须在20—30℃下处理15— 20min，促使害虫活动，再行检查。
方法有：组织分离法 稀释分离法 划线分离法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 6、血清学检验
方法有：免疫电镜技术 酶联免疫吸附技术 斑点免疫法 免疫荧光抗体法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 7、生理生化测定
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 2、染色检验法
对植物病原细菌检验可以用革兰氏染色法和 鞭毛染色法，对于植物病原线虫则用透明 染色法
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 3、直接镜检
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 一、现场检验检疫技术 • 1、直接检查：利用肉眼或放大镜 • 注意有无害虫的排泄物、脱皮壳、卵、 幼虫、蛹、茧和成虫诸虫态以及食痕 和危害状等。
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 一、现场检验检疫技术 • 2、过筛检验：取样携回室内进行过筛 检验，按粮谷、油料、豆类颗粒形状 和大小，选用不同孔径的规格筛
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• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 12、植物病原线虫的各种分离方法
过筛分离法：本法用于从大量土壤中分离各类线虫。将充分 混匀的土壤样品置于不锈钢盆或塑料盆中，加入2—3倍的 冷水，搅拌土壤并振碎土块后过20目筛，土壤悬浮液流人 第二个盆中并喷水洗涤筛上物，弃去第一个盆中和筛上的 剩余物，第二个盆中的土壤悬浮液经lmin沉淀后再按上法 过 150 目筛，从筛子背面将筛中物冲洗到烧杯中，盆中土 壤悬浮液再继续过325目和500目筛。筛中物收集在烧杯中 静置 20—30min ，线虫沉集底部，弃去上清液，将沉集物 转移到玻皿内镜检或吸取线虫鉴定。
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• 第二节 植物检验检疫新技术的应 用 • 四、随机扩增多态性DNA技术（RAPD） • 五、基因芯片检测技术