WJQ 2014.6Western Blotting1.以70%的ethanol擦拭glasses2.Glasses（大、小）置于固定架中、调整水平、lock、置支撑架、lock3.Add ddH2O to check glasses 是否有漏（Filter paper吸干水）齿梳用70%EtOH喷洗，纸巾擦干（桌面铺上纸巾）4.视Sample的大小决定Separating gel的浓度（一片约3-4ml所以配5ml）5.Formula10% saparating加1ml 2-propand／片压平，从中间加，向两边移动Seperating gel 凝固后（要充分一些≥1h）倒掉2-propand，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干6.protein sample 95~100℃煮沸3~5min，冰置7.取一定数量（20~60ul)protein, loading,同时需loading Marker作对照8.Run at 60~80v(浓缩胶)，then换成100~120v（分离胶）9.准备正好大小的滤纸和膜（NC或PDVF膜）用转印buffer浸透10.分开玻璃板，取出gel，将浓缩胶弃掉，用蒸馏水漂洗gel准备三明治：11.恒流260mA 70min 冰浴12.结束后，取出膜用G250漂洗5秒钟，蒸馏水脱色，看是否有气泡13.Blocking （10ml blocking buffer：5% milk 用1xTBST配制） RT shake 1h14.Discard blocking buffer，add 10ml 一抗 4℃作用1h（亦可RT shake1h） PBS（或5% milk）10ml加10ul一抗（稀释1000倍）15.Discard一抗，ddH2O wash，Add TBST wash 10min 3 times（shake）16.Add 10ml二抗RT shake 1h10 ml blocking buffer加2ul二抗（稀释5000倍）17.Discard 二抗 TBST wash 10min 3 times（shake）18.2ml／membrane的ECL substrate（1mlA+1mlB)染色1-2min19.将membrane以袋子夹，贴上Marker20.压片10s 30s 1min 2min一、蛋白质的样品制备：1.取贴壁培养的细胞，弃培养基；2.用预冷的PBS洗2遍，吸净PBS；3.每按照300uL/10-cm dish加入预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用细胞刮收集细胞到干净EP管中；(裂解液用量根据细胞数调整)4.快速振荡10-20s，冰上放置10 分钟，重复2-3次；5.12000×g，4℃离心10分钟，将上清转移到新的干净EP管中，即为蛋白样品溶液；6.Bradford法（595nm）或BCA法（562nm）对蛋白样品进行定量。
7.将样品稀释成相同浓度，如3ug/ul，加入1/6体积6×loading dye，沸水浴煮沸5分钟，5000rpm离心5min，准备上样。
具体步骤请参考试剂盒的说明书。
样品制备是关键步骤，要求尽可能获得所有蛋白质，应注意以下问题:在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后于-20°或-80℃中长期保存，但不要反复冻融，否则会使蛋白的抗原特性发生改变。
提取过程中应尽量避免发生明显的蛋白降解。
此外，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，并注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量Stock BSA：10 mg/mL：用ddH2O 稀释8倍，成1.25 μg/μL 工作液；Dye solution (Bio-rad)：用ddH2O稀释5倍（1:4）。
Procedure：1)Dye dilution: 1000 μL 998μL 996μL 994μL 992μL samle: 998μLBSA工作液: 0 2.0 μL 4.0 μL 6.0 μL 8.0 μL 2.0μL考虑到此处要求不是非常精确，直接用Dye dilution（1:4）1mL亦可。
2)RT, Incubate >5分钟(no more than 1 hour)3)Measure at 595 nm.BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。
可先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色以排除假阳性结果。
一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug。
建议使用等体积上样，即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积。
加样孔的最大限度约为30ul。
上样前要将样品在沸水中煮3~5分钟使蛋白充分变性。
也可以使用PCR仪95°加热5分钟。
之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。
三、SDS－PAGE电泳1. 清洗玻璃板：取少许洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
若不继续使用，需用75%乙醇擦拭后晾干后妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。
梳子应用水洗干净，临用前用75%乙醇擦拭晾干。
2. 灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶（可先往玻璃板间灌水试漏）。
②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。
配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。
灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。
梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。
注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐为插入的梳齿长再加1cm）。
③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
倒去上层水并用吸水纸吸干。
聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30分钟左右，AP不新鲜或气温较低会导致聚合变慢，但通常不会超过1h。
必要时可适当增加AP以及TEMED的量，由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以推荐APS每周新鲜配置。
④按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤等待积层胶聚合期间，取适量蛋白样品（含1X SDS loading buffer，最好预先分装好），95~100°加热5分钟，若有沉淀可用稍低温度，比如45~55°加热1h达到变性的目的。
可分装50ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，临用前用PCR仪加热95°C 5分钟，效果不错。
⑥胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。
加样前可用加样器或5ml注射器冲洗一下加样孔。
用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
目前我们做的胶上有10个上样孔，一般在头尾孔内加入两种不同的预染marker，中间8个孔加样品。
加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。
在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。
上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
也可使用10ul的枪头，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。
3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺，有方案建议通过低电压短时间预电泳清除凝胶内杂质、疏通凝胶孔径，但《分子克隆》却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。
电泳时间和电压按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接转印。
四、电转印1、将滤纸和NC膜切成与凝胶尺寸大小，置于转印缓冲液中平衡5分钟；2、转移：按照正极-海绵-滤纸-Nc膜-凝胶-滤纸-海绵-负极的顺序装好转印夹，260mA恒流转移60~70 min。
五、杂交1、取下Nc膜，做好标记（用油笔重新标记Marker，以防在后续步骤中被洗掉），去离子水冲洗，干净滤纸吸干；2、将Nc膜放于5%脱脂奶粉溶液中封闭1小时；3、PBST洗三次，每次5-10分钟；4、加入适当稀释浓度的一抗，4℃过夜；5、PBST洗三次，每次5-10分钟；6、加入二抗1:5000~10000，室温反应1小时。
7、PBST洗三次，每次5-10分钟。