・综 述・微卫星不稳定性的生物学意义及其应用前景3丁　一　童坦君(北京医科大学生物化学与分子生物学系,北京100083)摘要　微卫星为遍布于人类基因组中的简单重复序列。

在人群中,它们呈现高度多态性,并且稳定遗传。

微卫星的高度多态性是微卫星不稳定性的表现,它与错配修复基因的缺陷有关。

微卫星不稳定性已广泛应用于肿瘤学的研究,并依此提出了肿瘤发生的“增变基因”途径。

在遗传学、老年病学及其它一些生命科学,微卫星不稳定性同样具有广泛的应用前景。

关键词　微卫星不稳定性;错配修复基因;增变基因Microsatellite Instability:A Potential Tool for the study of Life Sciences　DIN G Y i,TON G Tan2J un(Depart ment of B iochemist ry and Molecular B iology,Beiji ng Medi2cal U niversity,Beijing100083)Abstract　Microsatellites are simply repeated nucleotide sequences scattered throughoutthe human genome.They are highly polymorphic among human population and inherit2ed in a stable manner.The microsatellite instability(M I)is highly polymorphic,whichis associated with the defects in DNA mismatch repair genes.M I has been widely usedby scientists to study the tumorigenesis.On the basis of their findings,a“mutator thatmutates the other mutator”model for tumorigenesis has been proposed.M I is also a po2tential tool for the study of genetics,aging and other life sciences.K ey w ords　Microsatellite instability;Mismatch repair gene;Mutator微卫星(microsatellites)遍布于人类基因组中,在动物及部分微生物基因组中也有存在。

它们是由同一脱氧寡核苷酸重复串联而成,重复顺序为1～6bp,重复次数不超过60次,片段长度通常小于350bp,在人群中表现出高度的个体特异性,并且稳定遗传。

人类基因组中包含数万个微卫星位点,由于它们一般处于可积累中性突变的非编码DNA区域,在人群中呈现高度多态性。

微卫星多态性是微卫星不稳定性(microsatellite instability,M I)的表现。

微卫星多态性表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间,微卫星位点的重复单位的数目不同。

微卫星多态性的检测采用PCR方法。

选择位于微卫星序列两3　国家自然科学基金资助课题(39670806)侧的合适引物,对基因组DNA进行PCR扩增,将扩增产物以变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。

对不同的标记引物,如荧光物质,同位素,生物素可分别采用不同的显示方法,不带标记的引物可以银染显色后观察结果。

与正常组织相比较,若某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上,记为杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH);若等位基因条带增多和大小有改变则记为M I。

传统的细胞遗传学核型分析检测LOH,将遗漏亚显微(submicroscopical)缺失,而微卫星标志物覆盖了许多基因组中的目的区域,克服了这个限制。

M I的产生原因可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现象。

DNA复制过程中,当复制复合物复制一个重复单位(repeat unit)后,子链与模板链分离,然后与下一个或下几个重复单位重新结合,使一个或几个重复单位形成”环凸”(looped out)区域。

正常情况下该结构可被错配修复系统(mis2 match repair system)所校正,但校正系统失常时,子链DNA如继续延伸即可引起突变[1]。

错配修复基因超家族属于管家基因(housekeeping genes),它们可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中出现的未配或错配的碱基,控制复制和重组的精确性。

该基因家族的突变将导致突变表型,表现为M I增加以及活性基因的高突变。

研究资料表明,错配修复途径的不同缺陷可对各个微卫星家族有不同的影响。

目前已发现人类6个错配修复基因,其中3个为细菌Mut S同源物,hMSH2、hMSH6 (GTBP)和hMSH3;另外3个为细菌MutL同源物,hML H1、hPMS1和hPMS2[2]。

大肠杆菌错配识别蛋白Mut S的人类同源物(homologs)为hMut Sα,它是hMSH2和GTBP(G.T结合蛋白)的二聚物。

二者之一的突变即难以识别G.T。

大肠癌HCT15和M T1细胞系的GTBP突变失活,可引起体外单碱基错配和单核苷酸突环(loops)的选择性修复能力丧失,但不影响二核苷酸突环的修复。

由此反映为HCT15和M T1出现单核苷酸M I,而不是双核苷酸的M I。

hMSH2突变则不仅不能修复单碱基错配,而且不能修复单碱基突环和二碱基突环,在hMSH2有缺陷的细胞中的M I即包括单核苷酸也包括双核苷酸。

人类细胞的大肠杆菌MutL蛋白同源物为hMutLα,是hML H1和hPMS2的二聚体。

其突变体出现相当多的单核苷酸和二核苷酸M I,提示hMutLα涉及单核苷酸和双核苷酸的修复[1]。

在单核苷酸和二核苷酸M I中,错配修复缺陷为重要原因,但错配修复途径在稳定较长重复顺序中起何作用还不清楚。

hPMS2缺陷细胞系的三核苷酸重复顺序相当不稳定,如果这是hPMS2缺陷型细胞的特性,说明这个基因的产物为纠正三核苷酸重复位点复制错误所必需,由此说明错配修复也能校正三核苷酸重复区的复制错误。

体外错配修复试验表明,二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸的突环可作为依赖hMut Sα和hMutLα校正体系的底物;hMutLα和hMut Sα缺陷型细胞株的抽提物,其修复含有1～4个碱基重复序列突环的能力相当差。

GTBP突变体细胞系HCT115和M T1,在体外对二碱基、三碱基和四碱基突环的修复具相当效率,它们不显示三核苷酸M I[1]。

hML H1缺陷型细胞系HCT116,在体外不能修复含一个错配(或未配)及二个、三个、四个未配对碱基的DNA,但可修复含五、八和十六个未配对碱基的DNA,表明5个以上碱基突环的异源双链的修复与较小错配的修复有差别。

hMSH2缺陷型大肠癌细胞系LoVo,即不能修复未配或错配一个碱基的DNA,也不能修复由2～5个碱基组成的DNA突环,表明突环异源双链的修复需要hMSH2,尽管LoVo细胞可能还有其它突环修复的缺陷[3]。

有研究表明,hMSH3基因对2～4核苷酸重复的错配修复起重要的作用[4]。

一、MI在肿瘤研究中的应用自1993年,M I应用于遗传性非息肉性结直肠癌(hereditory non2polyposis colorectal can2cer,HN PCC)研究以来,M I已应用于胃癌、大肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤。

HN PCC病人与几个错配修复基因的缺陷有关。

Muta等研究了M I与大肠癌的关系,HN PCC 高危组的M I为35%,确诊组M I为65%[5]。

E2F4为E2F家族的一员,编码转录因子。

E2F4外显子有13个CA G重复序列,在M I阳性大肠癌中可发生改变,17例高频M I位点的肿瘤中,11例具E2F4基因的突变。

在这11例E2F4基因突变的大肠癌中,9例在hMSH3基因第7外显子的8个A重复具肿瘤特异性移码(frameshift)突变。

再者,17例hMSH3突变肿瘤中12例具E2F4基因突变。

可见E2F4基因与hMSH3基因突变之间明显相关。

在具有M I表型的人类肿瘤中,E2F4基因的CA G重复顺序可能是缺陷型hMSH3蛋白的靶位点。

CA G减少的E2F4基因的产物,丝氨酸区域较短,该区域可能为活性转录因子所必需。

大肠癌的E2F4基因突变及其紧密关联的hMSH3的基因突变,产生突变型E2F4蛋白或可促进细胞的增殖[4]。

M I阳性胃癌中,凋亡相关基因BAX、hMSH3和hMSH6的移码突变率分别为64%、64%和52%,而M I阴性胃癌中无此类突变。

TGFβRII和IGFR基因的突变率在M I阳性胃癌中分别为72%和8%。

在M I阳性的大肠癌中,BAX、hMSH3和hMSH6的突变率分别为50%、43%和29%。

TGFβRII和IGFR基因突变率分别为90%和20%。

BAX、hMSH3和hMSH6基因的突变率在M I阳性胃癌中稍高,而TGFβRII和IGFR突变率则在M I阳性大肠癌中较高。

BAX的突变只出现在M I阳性胃癌中,但其它对肿瘤有抑制功能的基因无此现象,表明在胃癌的发生中,BAX基因突变具有重要意义[6]。

王永信等研究了中国人胃癌组织在29个微卫星位点上平均M I频率为33.9%,胃癌的不同病理类型表现出不同的M I,低分化胃癌和印戒细胞癌与高分化癌比,M I频率明显增高[7]。

肿瘤发生是体细胞突变累积和克隆扩增的多步过程。

微卫星位点的多样性(diversity)可以反映肿瘤中错配修复系统失活后细胞分裂的次数[8]。

肿瘤发生有两条途径,即抑癌基因失活途径和增变基因(mutator)途径。

在增变基因途径中,某些错配修复基因(初级增变基因)的缺陷和细胞增殖的共同作用,引起肿瘤基因组的不稳定性。

由于次级增变基因,如hMSH3和hMSH6,含有初级增变基因作用的靶位点(微卫星位点),初级增变基因可选择性地作用于次级增变基因的上述位点,加速它们的突变。

突变的次级增变基因使肿瘤细胞基因组不稳定性的深度和广度扩大,基因组不稳定性增高进一步加速了肿瘤发生过程中的癌基因突变的累积[9]。

二、微卫星在衰老研究中的应用衰老机制的研究有两条途径,其一是鉴定细胞老年期变化,确定这些变化不是单纯与老化相关,而是导致老化;其二是通过寻找引起生物衰老速率变更的突变体,找出调控衰老速率的基因[10]。