1、目的：对生产部制剂车间的灌装机进行培养基无菌灌装试验,通过灌装后的产品污染程度检测灌装工艺能否保证产品的无菌。

2、范围：生产部制剂车间的灌装生产线。

3、责任：3.1验证小组3.1.1设计、组织和协调验证试验。

3.1.2准备、检查和批准验证方案。

3.1.3准备验证报告并且流转批准。

3.1.4评估所有的测试结果。

3.1.5完成此文件规定的验证报告。

3.1.6验证小组成员名单3.2生产部3.2.1对灌装车间进行清扫、消毒，保证环境清洁。

3.2.2操作灌装机。

3.2.3按照规定的程序进行培养基灌装。

3.2.4进行日常清洗、维护。

3.3QA3.3.1取样。

3.3.2进行目检。

3.3.3进行环境监测。

3.3.4检查和批准验证方案和报告。

4、描述制剂车间使用x公司的灌装流水线，包括：洗瓶机、隧道烘箱、灌装机、轧盖机，y公司的冻干机进行冻干。

5、程序5.1使用的设备及材料5.1.1洗瓶机5.1.2隧道烘箱5.1.3灌装机5.1.4冻干机5.1.5灌装材料5.1.5.1瓶子5.1.5.2胶塞5.1.5.3铝盖5.1.6培养基5.1.7菌种5.1.7.1枯草杆菌(Bacillus Subtilis) ATCC 66335.1.7.2白色念珠菌(Candida alblcans) ATCC 102315.1.7.3厂房环境分离菌5.2培养基准备5.2.1在10L血清瓶中加入2L的热注射用水，再加入240g胰蛋白胨大豆肉汤充分搅拌，等溶解后再加入6L的热注射用水，整个培养基量为8L。

5.2.2将配制好的培养基放到高压蒸汽灭菌柜中121℃灭菌30分钟，灭菌后取出血清瓶，从瓶中取4瓶（50ml/瓶）作为阴性对照，其中2瓶于32±2℃培养14天，另外2瓶于23±2℃培养14天。

观察有无微生物污染。

5.3培养基无菌灌装5.3.1准备无菌的灌装器具(针、硅管、等等)，联接到灌装机上。

硅管一头放入灭菌培养基中。

5.3.2用的瓶子，胶塞和铝盖按标准操作规程（P-SOP-048,P-SOP-049）进行洗涤，灭菌。

5.3.3按标准操作规程（P-SOP-051）进行液量调节，按标准操作规程（P-SOP-050）进行灌装，每瓶灌装2ml灭菌培养基。

5.3.4使用2个针头进行灌装，每瓶2ml。

灌装的速度为70瓶／分钟。

5.3.5灌装的总瓶数为3000瓶以上，全部为半压塞。

5.3.6灌装时将瓶子按顺序放箱中，给箱编上号，以便能够追查出受污染的瓶子灌装时状态。

5.3.7灌装结束后，将半压塞的培养基转移至冻干机中，在机内压塞。

5.3.8加塞结束后将瓶子转移至轧盖间进行轧盖。

5.3.9将灌装好的瓶子倒置于32±2℃培养7天，然后在23±2℃培养7天。

5.4环境检查5.4.1 按照100级和10,000级洁净级别检查项目实施，下面为实施项目：5.4.1.1浮游菌测定5.4.1.1.1在灌装过程中的关键操作点采样。

5.4.1.1.2使用仪器 : FKC-1型浮游空气尘菌采样器()。

5.4.1.1.3参照SOP(QA-SOP-112)《浮游菌测定标准操作规程》进行检测。

5.4.1.2尘埃粒子测定5.4.1.2.1在灌装过程中的关键操作点采样。

5.4.1.2.2仪器：光散射尘埃粒子计数器（）5.4.1.2.3参照SOP(QA-SOP-106)《尘埃粒子测定标准操作规程》检测。

5.4.1.3表面菌测定5.4.1.3.1表面菌采用RODAC培养皿进行测定5.4.1.3.2在灌装中对各测试点进行取样，特别是在离灌装针头30cm以内的区域。

5.4.1.3.3 对无菌服的袖子和胸部以及操作人员的手套取样。

5.4.1.3.4 参照SOP(QA-SOP-108)《表面菌测定标准操作规程》进行检测。

5.4.1.4 沉降菌5.4.1.4.1培养皿：营养肉汤琼脂培养平板（φ90）。

5.4.1.4.2参照SOP(QA-SOP-107)《沉降菌测试标准操作规程》进行检测。

5.5灌装培养基灵敏度试验5.5.1从灌装的培养基中每1000瓶抽取20瓶，从每箱中均匀取样，20瓶接种0.1ml(含约100CFU)枯草杆菌(Bacillus Subtilis) ATCC 6633，20瓶接种(0.1ml约含100CFU)白色念珠菌(Candida alblcans) ATCC 10231。

5.5.2剩下的20瓶用于接种0.1ml(含约100CFU)厂房检查分离菌。

5.5.3将接种枯草杆菌及厂房环境分离菌的瓶子放置到32±2℃的恒温箱培养7天，将接种白色念珠菌的瓶子放置到23±2℃的恒温箱培养7天，观察菌的生长情况。

6、灌装培养基的培养及计算污染度(%)6.1 培养基倒置到32±2℃的恒温箱内培养7天。

然后在23±2℃的培养箱中培养7天。

6.2 进行周期性的检查(7天一次)，检查受污染的瓶子数在其箱上编上号并记录。

6.3 假如受污染的瓶子有破损，在计算污染度时应将其排除在外。

6.4 未受到损伤的瓶子培养共14天。

6.5 污染度计算式染菌的瓶数（因瓶子破损染菌的除外）污染度（%）= ----------------------------------×100%灌装总瓶数－破损的瓶数7、合格标准7.1 灭过菌的培养基的阴性对照结果合格（无菌生长）。

7.2 培养基灵敏度试验中至少有50%的瓶中有明显的微生物生长。

7.3 环境检测符合以下基准：7.4培养基灌装污染率小于0.1%。

注射剂无菌保证工艺研究与验证常见技术问题（四）解答内容[注：以下均为2008年度第一期讲习班（注射剂无菌保证工艺研究与验证技术要求）参会代表所提问题，本期讲习班讲习组根据目前的有关技术要求，经过认真梳理、分析、总结后，现予以发布，并就相关问题进行讨论与交流。

]??? 30、培养基灌装试验中，培养基灭菌后、灌装前，再经滤膜除菌过滤，以观察滤器在消毒安装过程中的无菌效果，是否可行？??? 答：培养基灌装试验是对包括无菌过滤在内的所有步骤的无菌性保证程度的考察，推荐配制培养基后直接用于无菌过滤及随后的灌装过程，实际操作中要注意防止不溶性颗粒堵塞滤器。

??? 31、培养基灌装试验年度再验证每年两次，每次几批？??? 答：对于某个产品的年度再验证，通常的做法是每年进行两次培养基灌装试验，每次一批。

??? 32、中国药典2005年版无菌培养时间已变为14天，培养基模拟灌装后在两个温度的培养试验是否也需延长？?? ?答：总培养时间不得少于14天，可以分成两个温度（22.5度和32.5度）各培养至少7天，也可以一个温度（22.5度）直接培养。

??? 33、培养基灌装试验合格标准置信限为95%，染菌概率0.1%，请具体解释一下使用哪个统计方法，如何计算查表得出。

??? 答：有关计算公式的详细说明，可参照国家食品药品监督管理局药品安全监管司和药品认证管理中心组织编写的《药品生产验证指南（2003）》（化学工业出版社）一书第258页。

??? 有两种计算方法。

一种是采用泊松分布的近似值计算公式，即??? P（X>0）=1－e-Np>0.95??? 其中，P为置信限，N为模拟分装瓶数或批量，p＝0.1％（污染概率）??? 另一种计算方法是更为精确的二项式计算公式，即??? P(X>0)=1－（1－X）N??? 其中，P为置信限，N为模拟分装瓶数或批量，X=0.1％（污染概率）??? 在书中的第259页，列有“可信限为95%时一次模拟分装中模拟分装量、污染数量与污染概率关系表”，可从该表查出模拟分装数量与污染数量的对应数值。

??? 34、在讲义72页第59张片子中提到粉针剂、冻干粉针、小容量注射剂工艺验证的异同点中培养基灌装程序的差异主要是指什么，具体怎样做，起始点是哪里，从哪里开始到哪里结束？??? 答：对于无菌粉针剂，培养基灌装的形式有一些特殊性，如要准备模拟的无菌粉末，分装后用注射器将液体培养基加入瓶中；或将无菌培养基粉末分装，结束后用注射器加入无菌注射用水。

但目的仍是考察整个无菌分装过程的无菌保证程度。

??? 35、如何进行容器密封性验证？??? 答：容器密封性验证常采用物理和微生物学检测手段。

物理检测有许多优点，如灵敏度较高、使用方便、检测迅速及低成本等。

在产品有效期内，均可使用物理检测方法来确定包装完整性是否符合规定要求。

进行包装完整性检测的一个重要原因是确保无菌产品始终保持无菌状态。

因此，在产品包装的研发阶段，应考虑采用微生物侵入试验，或采用经验证过的并且比微生物检测更为有效的物理试验方法，来检测产品包装的完整性。

但是，对效期内产品的稳定性试验来说，因进行微生物侵入试验较为困难，故建议采用物理检测方法。

微生物侵入试验是对最终灭菌容器／密封系统完好性的挑战性试验。

在验证试验中，取输液瓶或西林瓶(小瓶)，灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌。

然后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入，确认容器密封系统的完好性。

同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。

??? 36、在采用微生物浸泡法进行容器密封性验证时，为什么要事先去除铝盖，请问除去铝盖后，是不是只剩胶塞，那么在试验过程中会不会发生药液泄露而影响验证结果？??? 答：去除铝盖是为了造成一个更为严格的条件，讲课中以冻干粉针剂为例，通常容器内有较高的真空，不会造成漏液，试验者可根据自己产品的特点判断去除铝盖是否适用。

??? 37、密封性验证中，如铝桶的验证，用培养基验证无法观察结果，是否有其他方法？?? ?答：对于无菌原料的容器，建议尝试物理的方法，如盐水渗入法。

??? 38、密封性验证一般每次取样量是多少，再验证的周期是多少？??? 答：可以从压盖线上从开始、中间、结束各取至少10瓶进行试验，起始验证应考察有效期内不同时间的密闭性，再验证一般一年可进行一次。

??? 39、验证指南中对大输液产品的密封性验证有相关的要求，但对分装及冻干产品无要求，是否不需进行密封性验证？??? 答：对大容量注射剂、小容量注射剂、粉针剂均应进行容器密封性验证。

??? 40、容器密封性测试是否在安瓿、西林瓶等所有注射剂型中都必须完成？??? 答：容器密封性测试在安瓿、西林瓶等所有注射剂型中都必须进行。

但采用的方法不尽相同，安瓿一般采用物理测试方法，西林瓶则采用物理和微生物学检测方法。

对于无菌灌装产品，还应包括环境监测记录。