• 室温下，将玻片置于0.1%NP40/SSC溶液中漂洗0.5～1 分钟
• 室温下将玻片置于75%乙醇中漂洗3分钟 • 自然干燥玻片 • 滴加DAPI复染剂于杂交区域，盖上盖玻片，暗处放置
10～20分钟后，荧光显微镜观察结果
乳腺癌HER2基因FISH检测实验操作 经验交流
HER2基因FISH实验操作经验交流
HER2基因FISH实验操作经验交流
组织固定 及制片
组织切片 的预处理
变性杂交
洗涤复染
组织切片的预处理
组织切片预处理的目的是什么？ • 固定过程中固定液的交联作用使胞质或胞核内的各种生
物大分子形成网络，影响探针的穿透力 • 组织中的核酸可与细胞内的蛋白质结合，以复合体形式
存在于细胞质或细胞核中 • 预处理的目的是消除固定液的交联作用、增强组织的通
• 变性 • 杂交
洗涤复染
• 切片洗涤 • DAPI复染
操作步骤一、组织固定及制片
• 使用10%中性缓冲福尔马林固定组织 • 固定时间为6～72小时 • 组织的脱水、浸蜡、透明、包埋 • 石蜡包埋的组织切取3µm切片 • 65OC烘烤过夜
操作步骤二、组织切片的预处理
• 二甲苯室温脱蜡2次，每次10分钟 • 室温置于100%酒精中2次，每次5分钟 • 梯度酒精复水 • 90OC去离子水处理切片30分钟 • 2×SSC漂洗两次，每次3分钟 • 将组织切片置于200µg/ml蛋白酶K消化液中消化5-20分钟 • 2×SSC漂洗两次，每次3分钟 • 室温下使用甲醛固定液固定切片10分钟 • 梯度酒精脱水，干燥玻片
组织固定 及制片
组织切片 的预处理
变性杂交
洗涤复染
组织固定脱水处理不良案例分析
• 外院送检蜡块，临床诊断为浸润性乳腺癌，申 请FISH检测HER2基因状态
• 蜡块外观良好，但有刺鼻的福尔马林味道，固 定液类型未知，组织固定时间未知
• 切片厚度为3µm
组织固定脱水处理不良案例分析
组织固定脱水处理不良案例分析
• 使用蛋白酶消化组织，不仅可以增加组织的通透性， 而且还可以消化细胞核周围的蛋白质
• 酶消化的适宜程度对FISH检测信号的质量有非常大的 影响
组织切片的蛋白酶消化
蛋白酶消化不足
蛋白酶消化过度
组织切片的蛋白酶消化
蛋白酶K消化时间的掌控
3min 5min 8min
变性杂交
洗涤复染
HER2基因FISH实验操作经验交流
组织固定 及制片
良好的组织固定 及脱水处理是FISH 实验成功的基础
组织切片 的预处理
变性杂交
洗涤复染
组织的固定及制片
• 肿瘤组织离体后应在1小时内固定 • 如果组织较大，应将其每隔5～10mm切开 • 使用10%中性缓冲福尔马林固定液 • 固定时间为6～72小时 • 良好的组织脱水、浸蜡、透明处理 • 切片厚度为3µm
操作步骤三、变性杂交
甲酰胺手工变性杂交
•将探针置于83OC水浴箱变性5分钟后，迅速放置于42OC水浴箱 •将玻片置于预热至83OC的甲酰胺变性液中变性5分钟 •再将玻片依次置于-20OC预冷的70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇梯度 脱水 •自然干燥玻片后，将玻片置于42OC烤片机上预热 •将探针滴加在玻片的杂交区域，加盖玻片，用橡皮胶封边 •将玻片置于预热的湿盒内，42OC恒温箱中杂交过夜
操作步骤三、，加盖玻 片，用橡皮胶封边 •将玻片放置于杂交仪内，选择相应的运 行程序，将玻片与探针进行共变性 •变性条件为83OC 5分钟，杂交条件为 42OC 16小时
操作步骤四、洗涤与DAPI复染
• 移去盖玻片，将玻片置于预热至67OC的0.3%NP40/SSC 溶液中，漂洗2分钟
乳腺癌HER2基因FISH检测经验分享
郑州大学第一附属医院病理科 张岚
主要内容
• 荧光原位杂交检测的原理 • 乳腺癌HER2基因FISH检测操作步骤 • 乳腺癌HER2基因FISH实验操作经验交流
荧光原位杂交检测的原理
荧光原位杂交检测的原理
• 用荧光素标记的DNA探针，利用探针与被测样本DNA碱基 对的互补性，在探针与样本的DNA杂交后，通过荧光显 微镜观察荧光信号
乳腺癌HER2基因FISH检测 操作步骤
乳腺癌HER2基因FISH检测操作流程简图
组织固定 及制片 组织切片 的预处理
变性杂交
洗涤复染
乳腺癌HER2基因FISH检测操作流程简图
组织固定 及制片
组织切片 的预处理
变性杂交
• 组织固定 • 脱水浸蜡包埋 • 切片
• 切片脱蜡水化 • 酶消化前的预处理 • 酶消化
透性、充分暴露杂交位点
组织切片的预处理
组织切片的预处理
酶消化前的预处理
蛋白酶消化
组织切片酶消化前的预处理
酶消化前组织切片预处理常用方法 • 30%酸性亚硫酸钠50OC处理20～30分钟 • 去离子水90OC处理组织切片30分钟
酶消化前预处理方法的经验分享 • PH6.0 0.01M柠檬酸盐缓冲液，高压5分钟
• 使用柠檬酸盐缓冲液高压处理组织切片的预处理方 法在消除固定液的交联作用、增强组织的通透性方 面有较明显的优势
组织切片的预处理
组织切片的预处理
酶消化前的预处理
蛋白酶消化
组织切片的蛋白酶消化
• 组织切片的预处理，常用蛋白酶K、胃蛋白酶对组织 切片进行酶消化
• 蛋白酶K常用浓度为200µg/ml ，胃蛋白酶常用浓度为 0.1mg/ml
组织固定脱水处理不良案例分析
• 使用其他公司探针进行重复性实验，结果基本相符 • 根据蜡块有福尔马林味道分析，可能存在组织脱水不良
的情况 • 组织脱水不良导致固定液残留于组织中，对蛋白质过分
固定，导致蛋白酶消化效果不好，无法充分暴露杂交位 点
HER2基因FISH实验操作经验交流
组织固定 及制片
组织切片 的预处理
组织切片酶消化前的预处理
经病理诊断为淋巴瘤的切片，使用 IGH/CCND1融合基因探针
90OC去离子 水处理30min
PH6.0柠檬酸 盐缓冲液高压 5min
组织切片酶消化前的预处理
• 经验证，使用柠檬酸盐缓冲液高压处理组织切片， 对淋巴瘤FISH检测的荧光信号强度具有明显的改善 作用
• 柠檬酸盐缓冲液高压处理组织切片的方法，同样适 用于乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、胃癌等组织类型标本