克隆载体必须是安全的。
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Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
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O rig in o f R ep licatio n H in d II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
322的构建是质粒载体构建的 一个典范。
322的亲本质粒 2124，含有抗性基因 1，含有松弛型1的复制起点（） 101，含有抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
1、在菌体内将R119质粒（沙门氏菌中R1质粒 的一种变异体）的易位子3（携带有抗性基因） 易位到1质粒上，构成一个较大的质粒3(13.3)。
3
黏性末端环化
导入大肠杆菌
8(2.6)*
2、从质粒101获得四环素抗 性基因（)。
获得9（5.3)
3、向9引入抗性基因。
2124的3体内易位至9 获得312 (10.2,具有抗 性基因和抗性基因）
312
313 (8.8，
除去 抗性基因中的位点）
*
4、
313
去除两 个
318 （6.3)
第三章 基因工程载体
基因克隆载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。
基因克隆载体(克隆载体)：通过不同途径能将 承载的外源片段(基因)带入受体细胞，并在其 中得以维持的分子。
载体的功能及特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（）的结合
Cop
Rep
Pco
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利
用，如101, 1, , 313和322 (1977, ) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多
克隆位点区和新的遗传标记基因。如系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆
中的不同要求，如M13系列载体，含T3，T7，6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略
1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种
“元件”（小片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环分子（）的形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环分子（）或线形分子（）。
在变性条件下，质粒可成为单链分子 （）。
质粒分子大小1-100以上。
质粒的复制
质粒能利用寄主细胞的复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（）；纯双向性（F质粒）；既
有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
如、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（1）在接合型质粒
的存在和协助下，也能发生转移，这个过程由 和 基因 决定
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对重组分子的筛选具有重要意义
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体分子合适的位置有一至多个 克隆位点，供外源片段组入克隆载体分 子。
至少有一个复制起点，因而至少可在一 种生物体中自主复制。
至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组分子是否进入宿主细胞。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体
的构建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
以大肠杆菌的质粒为例： 1、1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 101、F、4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到
另一个细胞（接合作用），如F、、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
酶切
体外重组 322(4.3)
片断去掉 320(2.8) 酶切
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿载体是指专用于基因或片断无性繁殖的 质粒载体。
322质粒 系列的质粒载体
322质粒
具有较小的分子量，大小4363 可以克隆大到6的外源片断 具有两种选择标记，即和。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 抗性基因内可被 I, I, I切开，抗性基因可被 I, 切开，