由pSC101派生来的载体。
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略 1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体 2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
2、可转移性：在天然条件下，很多天然质 粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞 内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖 于质粒上的tra基因产物。
基因工程第三章
Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。 Non Conjugative plasmid 非接合型质粒 （不能自我转移的质粒）：质粒不能从一个细胞 自发的转移到另一个细胞。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
基因工程第三章
➢严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染 色体不复制时，它也不能复制,通常每个 细胞内只含有1个或几个质粒分子（1-3拷 贝）,如F因子。
基因工程第三章
2.质粒构建原则
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS 2、正确获得构建质粒载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选择合适的启动子 5、提高外源DNA的容量 6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
基因工程第三章
Review
基因工程第三章
3. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体
➢ColE1、pMB1、pMB9为松弛性质粒。 ➢具有低分子量、高拷贝数的优点。 ➢具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数
100需要表达大
量的基因产物。
基因工程第三章
（2）低拷贝数的质粒载体
基因工程第三章
二、质粒（plasmid）的基本特征
1、自主复制性 ：质粒DNA携带复制起始区 （ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
➢松弛型复制质粒（relaxed plasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝,如Col E1质粒。
不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被 逐渐地排斥（稀释）掉。
➢不亲和群（incompatibility group)：
指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
➢基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。
基因工程第三章
4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往 往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生 物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细 胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。 可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而 减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。
基因工程对载体的要求: 质粒的基本特征:自主复制性、 可转移性、质粒
的不相容性、携带特殊的遗传标记
质粒构建基本策略：
加入合适的标记基因、 增加或减少合适的酶切位点、 缩短长度 改变复制子 加装特殊的基因元件
基因工程第三章
质粒构建基本原则:
合适的出发质粒 正确获得载体元件 合适的选择标记基因 选择合适的启动子 提高外源DNA的容量 需要灭活出发质粒上的某些编码基因 构建过程应力求简单
基因工程第三章
➢ 载体 的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
基因工程第三章
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细 胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量 在1-500kb之间广泛存在于细菌.。
基因工程第三章
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因 内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因 （如tetr、ampr、cmlr等）失活。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
基因工程第三章
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors