蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。

结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。

关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。

可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。

由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。

本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。

本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。

2材料与方法2.1 材料与设备2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。

95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。

冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。

10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。

1mol/L NaoH溶液：4gNaoH溶解于100ml蒸馏水中2.1.3实验器材微生物恒温培养箱、紫外分光光度计、超净工作台高速离心机、恒温水浴锅、层析柱(1.0 cm×10 cm)、梯度混合器、核酸蛋白检测仪、台式记录仪移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等。

2.2 实验方法2.2.1酵母发酵液制备2.2.1.1培养基配置斜面培养基（豆芽汁葡萄糖培养基）：豆芽汁浸汁 100mL葡萄糖 5.0g琼脂 2.0g自然pH0.1MPa高压蒸汽灭菌20min摇瓶培养基：蔗糖 20.0g/L蛋白胨 5.0 g/LNa2HPO44.0 g/LMgSO40.5 g/LKH2PO41.0 g/LpH 5.0~5.50.1MPa高压蒸汽灭菌20min2.2.1.2试验方法2.2.1.2.1斜面培养基的制备及斜面接种称取新鲜豆芽10.0g置于烧杯中，再加入100mL水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足到100mL，即制成10%豆芽汁。

按每100mL10%豆芽汁加入5.0g葡萄糖，煮沸后加入2.0g琼脂，加热融化，补足水到100mL。

分装、加塞、包扎，0.1MPa高压蒸汽灭菌20min。

将灭过菌的斜面菌种培养基摆成斜面放置一段时间看有无染菌，用未染菌的斜面培养基接种菌种，该操作在超净工作台上完成。

2.2.1.2.2斜面菌种的培养将接种后的斜面试管培养基置于28℃的恒温培养箱中培养2d至斜面培养基上长满菌体。

2.2.1.2.3液体培养准确称取蔗糖糖20.0g，蛋白胨5.0g，Na2HPO44.0g，MgSO40.5g，KH2PO41.0g，加1000mL水加热，调pH5.0~5.5，每50mL培养基加到250mL三角瓶，包扎，0.1MPa 高压蒸汽灭菌20min。

将斜面菌体用接种环接种两环，在28℃的恒温摇床110r/min中培养2d。

2.2.2酵母蔗糖酶的部分纯化2.2.2.1.破碎细胞取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。

将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。

留0.5 mL 上清液为第一组分。

2.2.2.2.加热除杂蛋白将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。

在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。

之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。

留0.5 mL上清液为第二组分。

2.2.2.3.乙醇沉淀量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。

然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。

将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。

2.2.3蔗糖酶酶学性质的研究2.2.3.1pH对蔗糖酶活动性的影响按下表配制7种缓冲溶液（公用）：将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。

2. 准备二组各7支试管，第一组7支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650）。

另一组7支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。

所有的试管都用水补足到0.8ml。

3. 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min 后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。

4. 画出不同pH下蔗糖酶活性（ moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH 值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。

2.2.3.2温度对酶活性的影响本实验要测定0℃～100℃，之间7个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。

这7个温度是：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

每个温度准备1支试管，以乙酸缓冲液作为缓冲液。

2.2.3.2.1. 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，0.2ml稀释的酶，加水至0.8ml 加入0.2ml 0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。

须得到0.2～1.0A的吸光度，准备一个水的空白对照管用于测定所有的样品管。

2.2.3.2.2. 测定上列各个温度下的反应速度，每次用1支试管，均加入0.2ml 乙酸缓冲液均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L 蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。

记录每个水浴的准确温度。

2.2.3.2.3. 酶催化的各管A540值均进行酸催化的校正。

画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。

2.2.4酵母蔗糖酶的固定化2.2.4.1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联（1）称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。

（2）称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。

（3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。

注意：为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。

若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。

（4）壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。

加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。

2.2.4.2.固定化酶的制备（1）将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。

（2）将实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液1 mL用蒸馏水稀释至100 mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。

2.2.4.3.固定化酶的评价分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。

具体如下：33.1pH对蔗糖酶活动性的影响3.2 温度对酶活性的影响活力回收=固定化酶总活力数溶液酶总活力数×100%=10.8%相对活力=固定化酶总活力数溶液酶总活力数-残留酶活力数×100% =12.6%4 结论与展望通过初步的酶学研究, 蔗糖酶的最适pH为5、最适温度为35℃、固定化酶活力回收为10.8%，相对活力为12.6%。

蔗糖酶在pH2.0～6.5之间和温度25℃～55℃之间是稳定的, 即使在65℃时, 仍保留70%以上的酶活。

研究结果表明: 蔗糖酶的酶反应受果糖的竞争性抑制, 葡萄糖对蔗糖酶没有抑制效应。

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