取材→预处理→分离→纯化→活力检测→ 培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织 →愈伤分化→再生植株
取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、 愈伤组织或悬浮细胞
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化
1 原生质体的分离
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
2、原生质体培养的意义
① 比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸 酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采 用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体， 同时避免收集过程中原生质体的破损。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体分离纯化流程图
三、原生质体培养
1.原生质体的培养方法 (1) 固体培养法（平板法）：
将原生质体均匀固定于琼脂培养基上进行培养的方法。首先把制 备好的融化的琼脂培养基冷却至40℃，与等量原生质体悬浮液共同倒 入培养皿中，迅速而微轻摇动，使原生质体均匀铺在琼脂之中。 优点：
(2) 悬浮法（漂浮法）
原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后， 使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。
过程：加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面 的原生质体，反复操作。
这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一致，但 获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集 较沉降法困难。
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对 单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
第四章 原生质体培养与细胞融合
第一节 原生质体培养
一、 原生质体的培养概况
1、概念：
植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将植物细胞游离成原生质体， 在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成 细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完 整植株的过程。 原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法 （1）机械法： ①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁 分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
步骤：取材→预处理→酶液配制（过滤灭菌，包含果胶酶和 纤维素酶及渗透调节剂和质膜稳定剂） →酶处理(10ml/g， 抽真空，摇床，40r/s，26℃ 2～8h) →过滤离心。
优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器 官，双子叶植物叶肉细胞比单子叶更易分离。
缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。
(5) 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖 等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。
(6) 原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.20.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%)
(7) pH影响 5.4-6.0
酶解时间
酶浓度
酶解温度
3 原生质体的纯化（净化）
指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱 壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。
(1) 沉降法
原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过 滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。
过程：首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～ 169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心 （900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。
一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺 点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁胞间层 初Fra bibliotek壁 次生壁（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
2 影响原生质体数量与活力的因素
(1) 光:一般在黑暗静止条件下进行.
(2) 温度:酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性.
(3) 时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小 于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕.
(4) 细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素 酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可 使用蜗牛酶和胼胝质酶。
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
② 便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物 界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本 科植物，高光效植物，高抗植物）
③ 原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植 物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物 合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等
3、原生质体培养程序