重组蛋白包含体的复性[摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。
不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。
变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。
近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。
[关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins.Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。
它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。
但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。
包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。
如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。
近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。
文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。
1. 蛋白质的体内折叠细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。
Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。
实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。
近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。
在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。
现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。
重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。
蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有真核细胞中相应的协助蛋白折叠的系统。
当通过基因工程手段在大肠杆菌中表达外源蛋白时，额外的代谢负担给宿主细胞带来了压力，许多蛋白就会形成包含体。
一般来说，处于还原环境的细菌胞质不能有效的完成二硫键蛋白质的氧化折叠[6]。
也有研究表明，重组蛋白包含体的形成与蛋白质的一些主要的理化参数，如电荷平均数，易形成转角的氨基酸的含量，半胱氨酸及脯氨酸的比例，亲水性以及氨基酸总数等有关[7]。
2. 蛋白质体外折叠的机理1961年，Anfinsen发现，在自由能驱动下，变性后的牛胰核糖核酸酶(RNase A)可在体外通过空气氧化自发形成正确的二硫键。
这个经典的实验揭示了蛋白质一级结构和高级结构的关系，Anfinsen指出：蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部信息，变性的蛋白质在一定的条件下可以完全自发地恢复活性。
他还发现，在一个合适的氧化还原的环境下，蛋白质刚开始错搭的二硫键可以被打开并不断地移位，重排形成正确的二硫键[8]。
1970年，Taniuchi指出，把124个氨基酸组成的RNase A C末端的4个氨基酸去除，剩下的蛋白是无法再折叠形成天然的二硫键的，说明了不完整的RNase A结构域是无法正确折叠。
接着在1973年，Wetlaufer在进行蛋白质X-ray衍射分析时发现，蛋白质在折叠时，不同的结构域是独立进行折叠的[9]，1981年，Lesk和Rose[10]证明了独立折叠的结构域分成亚结构域进行折叠，甚至可以进一步的分割。
这些说明了折叠起始于肽链上相邻三四个氨基酸的作用，这些位点能形成二级结构单元（如α螺旋和β折叠）或疏水束，进一步折叠导致较大结构如结构域的形成。
Dobson以溶菌酶为材料深入研究了折叠过程。
溶菌酶有129个氨基酸，由α和β两个结构域组成。
在折叠过程中，先形成α结构域中的2个α螺旋，再形成另外两个α螺旋，再次是形成β结构域[11]。
捕捉到折叠过程中的中间态是70年代体外蛋白质折叠研究的一个重大突破。
实验表明，伸展的肽链(U)折叠成活性蛋白质并不是一步完成的，它经过早期折叠进入中间态(I),然后由中间态过渡到最终具有特定三维结构和生物活性的天然态(N)[12,13]。
1981年，Ptitsyn报道了在酸变性时，α-lactalbumin的一种不同于天然蛋白的紧密的结构，后来命名为“熔球态”(molten globule state)。
熔球态是蛋白质折叠过程的一种中间态，它具有与N非常类似的二级结构，但几乎或完全没有三级结构[14]。
中间体的形成很迅速，从中间体到天然构象折叠则是反应的限速步骤。
由于蛋白再折叠过程中会产生一些错误折叠的中间体，同时没有协助折叠的辅助蛋白和酶，同时受到聚集反应的竞争，体外折叠形成蛋白质天然构象所需时间很长，从十几小时到几十小时不等。
并不是所有的蛋白都象溶菌酶和牛胰核糖核酸酶一样，在一定的条件下，变性的蛋白质可以自发恢复具有完全活性的天然构象。
例如一些胞外蛋白酶（如α水解蛋白酶α－lytic protease，枯草杆菌素Subtilisin）等蛋白质的折叠和成熟必须要在前导肽的存在才能完成。
这些蛋白酶在体内是以含前导肽（Pro肽）的前体形式合成的。
通过蛋白酶切作用降解Pro肽后，蛋白质才成为成熟的有活性的酶。
1992年，Baker在α水解蛋白酶的体外复性研究的过程中捕捉到一种熔球态中间体，它在没有变性剂存在下，在生理PH值条件下可以稳定存在数周时间，一旦加入Pro部分，则迅速转变为有天然活性的酶。
Pro肽在蛋白质折叠过程中起到了一个分子内伴侣的作用。
现在已知许多蛋白酶的正确折叠必须依赖Pro肽的帮助[18]。
具有Pro肽辅助折叠机制的有各种蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等[15]。
3.重组蛋白的复性策略包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、经验性很强的工作。
现在，对蛋白折叠的反应机理的了解，使得设计蛋白的复性过程成为可能。
然而，每一种蛋白都有自己的特殊性，仍需不断的实验来摸索出一套最佳的方法。
同时在借鉴别人成功的复性方法的基础上，来改进自己的实验。
3.1包含体重组蛋白的变性包含体是相差显微镜下可见的重组蛋白的不溶沉淀，具折光性[16]。
通常一个大肠杆菌细胞中有一个包含体，所以包含体的质量和数量与发酵水平成正比。
包含体一般含有50％以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、膜蛋白OmpC、OmpF和OmpA，质粒DNA以及磷脂、脂多糖等[17]。
可以通过洗涤、蔗糖密度超离心等方法使包含体中重组蛋白的纯度提高到80％，方便后续的变复性操作，提高复性率。
在包含体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的。
它们之间的聚集靠非共价键维持，包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等，唯一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。
要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包含体，使蛋白变性。
变性即破坏非共价键，和用还原剂（如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇）打开二硫键[18]。
常用5～6M的盐酸胍，6～8M的尿素。
尿素和盐酸胍对蛋白质的变性作用符合Hofmeister规则[19]。
盐酸胍是一种离子型变性剂，它会影响下游的离子交换纯化。
但是，盐酸胍比尿素好，除了它本身较强的变性能力外(盐酸胍的变性能力是尿素的1.5～2.5倍)，尿素中的异氰酸盐或酯会引起蛋白质中氨基或巯基的不可逆修饰。
实验表明，在IL-4的变复性过程中，用盐酸胍来溶解包含体，可以增加蛋白质的复性，但是用尿素时，蛋白质很难恢复活性[20]。
极端PH 、高温、去污剂、高浓度的无机盐及有机溶剂都可以溶解某些包含体。
如去污剂正十六烷基三甲基氨氯化氨(CTAC)、SDS、Sarkosyl[21]也可用作变性剂，但去污剂会与蛋白分子结合并很难除净，限制了它们的应用。
另外，极端PH溶液主要是破坏蛋白的次级键，只适合极少包含体的溶解，如Okamoto.H等在用高碱性PH中溶解重组人glucagon包含体[22]。
此外，变性体系中应加入EDTA、EGTA等螯合剂来捕获一些金属离子，以防止这些金属离子带来的空气氧化，保持体系的还原性。
3.2 变性蛋白的复性方法除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，可以获得天然的活性蛋白。
应用的最普遍的再折叠方法有透析、稀释、超滤[21]。
透析是实验室最常用的办法，但耗时长，容易形成没有活性的蛋白质聚集体。
MaedaY 设计了一种缓慢透析的办法，用8mol/L 的尿素溶液作为起始的透析液，然后逐渐增加不含尿素的溶液来降低变性剂的浓度。
这种方法中变性剂浓度下降更连续，不会出现稀释法中变性剂浓度突变的情况，可能有助于减少某些蛋白质复性中的沉淀，提高活性蛋白收率。
应用这种方法使IgG的复性率在1mg/ml时达到70％[23].稀释是最简单、也较有效的复性方法。
经稀释，变性剂及还原剂下降至一定浓度时，蛋白质分子开始重新折叠，但处理的液量大，不利于工业放大。