IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性
一、表达产物处理
1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min
2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）
3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀
4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清
5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min
6、12000g 4℃离心20min
7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min
8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体
9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜
二、包涵体的纯化
1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用
2、取样取离心上清，标记柱前
3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱
4、取样取柱后，标记柱后
三、包涵体复性
1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净
2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约
100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

高速离心去除沉淀，超滤浓缩
试剂盒
Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（康为）市场价¥398
配制溶液
裂解缓冲液500ml
50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
含2M 尿素裂解缓冲液250ml
50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
2M 尿素
含1% Triton X-100 裂解缓冲液250ml 50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
1% Triton X-100
Binding Buffer (PH8.0) 500ml
0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素Wash Buffer (PH6.3) 250ml
0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素
Elution Buffer (PH4.5) 250ml 0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素
透析袋处理液(PH8.0) 1L
2% NaHCO 3
1mM EDTA
透析缓冲液（PH7.2）各500ml 4M /2M/1M/0.5M 尿素
20mM PB（PH7.4）
0.2M PB (PH7.4) 1L
19ml 0.2M NaH 2 PO 4
81ml 0.2M Na 2 HPO 4
10mM PBS (PH7.2) 1L
50ml 0.2M PB
NaCl 8.5~9g
加水至1L。