均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透 亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
parafilm封口膜将培养皿封严以防污染 在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见 的愈伤组织。
植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种 单细胞中所占的比例来表示。 植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细 胞数)×100％ 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方 法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌 握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚 未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的 红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其 上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲 洗照片计数。
2、看护培养 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织 看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞 培养方法
3、微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培 养在小室中的少量培养基上，使其分裂 增殖形成细胞团的方法，称微室培养。
特点： （1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖 形成细胞团的全过程 （2）培养基少，营养和水分难以保持， pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分 裂。
1-2、 酶解法： Takebe等（1968）最
早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉 细胞
加果胶酶
过滤、离心
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤： (1) 诱导产生愈伤组织； (2) 愈伤组织反复继代， 使组织不断增殖，提 高愈伤组织的松散性；
15ml medium/1g
继代
(3)将愈伤组织 在液体培养基 中培养，建立 悬浮培养物
机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性 在微生物发酵罐的基础上作如下改进： 搅拌装 置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式 因为植 物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养， 因此必须设计加液装置； 由于植物细胞的生理 活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害 气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观 察，一般还设计有取样口。
机械搅拌式培养系统
气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作
用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往 往是容易使培养物污染的部位，因此， 发展出空气提升式生物反应器，但其缺 点是搅拌不均匀
旋转式培养系统： 一般用于产品中 试或某些必需裂 解细胞才能获得 目的产物的培养， 其优点是控制精 确，处理灵活， 缺点是培养体积 较小。
行一些调节。
2、培养细胞的起始密度及细胞记数
（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细
胞能够增殖的最少接种量称为最低有效 密度或者临界的起始密度。
最低有效密度由于培养材料、原种 培养条件，原种保存时间长短、培养基 的成分不同而有差异，一般为104~105细 胞/ml
2）细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细 胞游离后要对分离的单细胞进行记数， 可用血球记数板
第二部分 细胞培养
定义 ：植物细胞培养（plant cell culture）
是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团 进行培养使其增殖的技术 根据培养规模:小规模培养和大批量培养； 根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等； 根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生 产物的细胞培养。
§1.单细胞分离 §2.悬浮培养 §3.单细胞培养技术
操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-
4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞
团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培
养物。
4、细胞生长的测定
对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态 的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其
§3.单细胞培养技术
一、植物单细胞培养的意义 1、建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化 上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、 抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、 高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经 济效益。 2、排除体细胞的干扰 3、利于对细胞活动跟踪观察
讨论:
A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培 养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的
培养基。 C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养
的细胞一直保持对数生长期。 D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间
太长，则会引起细胞的大量死亡和解体
细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm 一400Pm的团块，悬浮培养较难；
培养时需供氧，培养液粘度大；
具有群体效应；
因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量 较低；
细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化, 从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；
悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长 （25000~50000个/ML）。
E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细 胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，
指数越高，分裂进行的速度越快。 一般用孚尔根染色法，先将组织用 1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检，
统计500个细胞，计算。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全 由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组 织。
§2.细胞悬浮培养(cell suspension culture)
一、细胞悬浮培养的概念和意义 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养
基中进行培养增殖的技术。
Bioreactor for cceollntinuous suspensions
Shaker for suspension culture
二、单细胞培养的方法
1、细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的 细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基 上进行培养，称之为平板培养 主要技术要点： 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团 不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要 选择合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基 洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml
5、植物细胞培养需要解决的问题
（1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均 不利于生长； （2）营养物的供应； （3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化 （4）培养过程中细胞的分化的防止， （5）细胞取得中微生物的去除； （6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力 要小；
二.培养系统
悬浮培养系统
机械搅拌式培养系统
Fujimura分离胡萝卜悬浮液
悬浮液
47μm膜过滤
滤液
31 μm膜过滤 收集
加入到10%~18%的Ficoll 加入等体积的培养基 网上细胞
180g离心5min
收集各法。低温处理可以提高培养体系中 细胞同步化的程度。 2、化学方法 1）饥饿法
悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分 裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1 或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养 基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会 同步进入分裂。
§4.植物细胞大规模培养与次生产物生产
§1.单细胞分离 完整的植物器官分离单细胞 由培养组织中分离单细胞
1-1、 机械法 第一种方法：用刀片刮叶片
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉 过滤、离心
注意 ： 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触 点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
2、固定化培养系统
细胞固定化培养技术按照其支持物不同可 以分为两大类：
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细
胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期的细胞。
常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿 嘧啶、羟基尿等。 3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度 一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。