（二）、酶解法
利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出 具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中 胶层，还能软化细胞壁。所以，用该法分 离细胞时，对细胞给予渗透压保护，如添 加适量甘露醇。
二、通过愈伤组织诱导获取 植物细胞
（一）、概念 愈伤组织：植物各种器官的外植体在离 体的条件下，细胞经过脱分化等一系列过 程，重新转化为未分化细胞，继而形成一 种能快速增殖的无特定结构和功能的薄壁 细胞团，称为愈伤组织。
（二）、细胞密度。单细胞培养要求接种 的细胞有一定的密度。过低，不利于细 胞生长繁殖，过高，则难得到单细胞系。 （三）、植物生长激素。主要是生长素和 分裂素。
（四）、温度。一般控制在25度左右，许可 范围内适当提高温度可加快单细胞生长速 度。 （五）、PH。一般控制在5.2~6.0 （六）、CO2含量。植物细胞培养系统中 CO2含量对细胞生长繁殖有一定影响。
（一）、原生质体的分离
1、机械法：使细胞发生质壁分离，然后切开 细胞壁使原生质释放出来。 特点：排除了外加酶对原生质体结构和 代谢的不利影响，但产生的原生质体少，对于 细胞质浓密、液泡小的分生组织不适用。
2、酶解法：将果胶酶和纤维素酶混合处理材料。
特点：能在较短时间内获得大量原生质体， 并能从分生组织获得原生质体，但是，酶可能对 原生质体有毒害作用。
（三）、从愈伤组织分离得到植物细 胞
诱导获得的愈伤组织可以用小刀或镊子 分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组 织转移到液体培养基中，加入杀菌的玻璃 珠，振荡培养，使愈伤组织分散成小细胞 团或单细胞，然后过滤，得到一定体积的 小细胞团或单细胞悬浮液。
三、通过原生质体获取植物细胞
原生质体：出去细胞壁后得到的微球体。
含义：将愈伤组织培养在一定容积的密
闭容器中进行培养。它是进行细胞生 长 和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方 法。
植物细胞培养技术的概念
植物细胞培养：是指从植物体中获 得 植物细胞，然后在一定的条件下培养， 以获得所需的细胞或各种产物的技术过 程。
植物细胞培养技术的理论 基础
植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包 含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完 整植株的遗传能力。 细胞分化：细胞在生长发育的过程中，在形 态、结构、生理功能等方面发生某些特异性差异 的过程。 脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的基 因活动模式会发生可逆的变化，重新回到未分化 状态，这个过程成为脱分化。
2、基本过程
（1）、单细胞悬浮液的密度调整 （2）、固体培养基的配制 （3）、接种单细胞 （4）、培养 （5）、继代培养
（四）、条件培养法
将单细胞接种于条件培养基中进行 培养，使细胞生长繁殖，而获得有单细 胞形成的细胞系的培养方法。
植物单细胞培养的条件
（一）、培养基。不同种类植物单细胞对 营养成分的要求各不相同，要根据不同 的要求配置培养培养基。
3、影响因素：材料的种类与生理状况、酶的种 类与浓度、酶解时间、渗透压稳定剂和质膜稳定 剂等。
（二）、原生质体的纯化
供体体材料经酶处理后，除有完整的原生质体外 还有未被消化的细胞、破碎的原生质体，叶绿体、线 粒体等，可以用镍丝网除去较大碎屑，进一步纯化方 法有下三种： 1、沉降法：离心，使原生质体下沉，碎片留于 上清液。 2、漂浮法：根据密度不同，利用密度大的高渗 溶液，离心后使原生质体漂浮其上，碎片等沉底。 3、界面法：采用两种不同密度的溶液，离心后 使完整的原生质体处于两液相的界面。
（二）、影响愈伤组织诱导的因素
• 1、要有合适的外植体。一般来说，外植体细 胞分化程度越高，脱分化越困难，所需时间越 长 • 2、要有适宜的培养基和培养条件。植物激素 的种类和浓度最为重要。 • 3、光照和温度也影响愈伤组织的发生。 • 4、NH4+/NO3-的浓度比对愈伤组织的诱导 也有影响。浓度比为4:1时，诱导率最高。
（三）、原生质体再生形成植物细 胞
原生质体分离后，经过技术和适当稀释，在 一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生， 从而得到植物单细胞，单细胞培养，长成细胞团， 再经过继代培养，形成由原生质体形成的细胞系。 采用固体培养或者液体静止培养，形成植物细胞。
植物单细胞的培养方法
（一）、看护培养法
1、概念； 采用一块活跃生长的愈伤组 织块来看护单细胞，使单细胞持续分裂和 增殖，而获得单细胞形成的细胞系的方法。
植物单细胞的获取
一、从外植体直接分离细胞
（一）、机械捣碎法 先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后 通过过滤和离心分离细胞。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优点： 1、获得的植物细胞没有经过酶 的 作用，不会受伤害。 2、不需要经过质壁分离，有利于进行生 理生化研究。
缺点： 由于受到机械作用，细胞结构会受到一 定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少。
细胞悬浮培养
（一）含义及特点 1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养
基中进行的无菌培养
2、特点
1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体， 适于大规模培养； 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细 胞的生长、分化创造方法和条件。
3、悬浮培养类型和方法
成批培养 连续培养
（1）、成批培养/分批培养
（二）、微室培养法
1、概念； 将接种有单细胞的少量培 养基，置于微室中培养，使单细胞生长 繁殖的方法。 2、特点：使用培养基用量少，可通 过显微镜观察个体细胞的生长、分裂、 分化、发育情况。利于对单细胞全过程 进行跟踪。
（三）、单细胞培养法
1、概念：将单细胞接种于固体培养基， 在培养皿中进行培养，使细胞生长繁殖， 获得由单细胞形成的细胞系的培养方法。
2、基本过程：
（1）、配制好宜于愈伤组织继代培养的固体培养基。 （2）、将生长活跃的愈伤组织块植入固体培养基中间部位。 （3）、愈伤组织上方放置一片面积为1平方厘米的滤纸，滤纸下 方紧贴培养基和愈伤组织块。 （4）、取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方。 （5）、置于培养箱，在一定的温度和光照条件下培养若干天， 单细胞在滤纸上进行持续分裂和增殖，形成细胞团 （6）、将细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获 得由单细胞形成的细胞系。