抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：汪治华, 张国成*, 许东亮, 孙新, 李小青, 李思袖, 张学红, 聂晓晶, 豆玉凤【摘要】目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径。
方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA。
用PCR扩增轻链和重链Fd段（即重链的可变区和第一恒定区）基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库。
对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。
结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因。
因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集。
结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础。
【关键词】抗体库; 噬菌体展示技术; Fab抗体; 呼吸道合胞病毒; 儿童随着分子生物学的发展, 基因工程抗体技术的出现, 尤其是噬菌体抗体库技术, 为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径, 成为抗体工程领域革命性的进展［1］。
我们以52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因来源, 成功地构建了一个人源性Fab段免疫噬菌体抗体库, 并对其进行了初步鉴定, 为研制诊断、治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础, 同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。
1 材料和方法1.1 材料选取52例经ELISA法检测呼吸道合胞病毒IgM和/或IgG 抗体阳性的患儿, 每例患儿抽取血液2 mL, 共约100 mL。
噬粒载体pComb3x（含氨苄青霉素抗性基因）, 大肠杆菌菌珠 XL1Blue（带四环素抗性基因）, 辅助噬菌体M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四军医大学李郁博士惠赠。
焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司, TRIzol 购自Invitrogen公司, RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司, Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司, 限制性内切酶Spe I、Xho I、 Sac I、 Xba I购自Promega公司, 呼吸道合胞病毒Long 株（RSV Long）, 由本实验室保存。
1.2 方法1.2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取用淋巴细胞分离液分离约100 mL外周血淋巴细胞, 用TRIzol法提取总RNA, 取适量进行甲醛变性胶电泳并用分光光度计测A值以鉴定RNA的质量。
1.2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增 PCR引物设计及扩增参照文献［2］, 共23条引物, 由Generay Biotech 公司合成。
按RNA 逆转录试剂盒中的说明, 将总RNA逆转录为cDNA, 以其为模板, PCR 扩增轻链及重链Fd段基因, 扩增条件为: 94℃ 50 s, 55℃ 50 s, 72℃ 1 min, 共30个循环; 并分别引入酶切位点Sac I+Xba I和Spe I+Xho I。
将全部抗体基因产物经琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 轻链基因库和Fab段抗体基因库的构建及鉴定轻链基因的扩增产物经Sac I和Xba I双酶切后回收, 与经同样酶切回收的pComb3x载体片段相连接, 并电转化E.coli XL1Blue感受态菌, 构建轻链基因库。
取适量菌液稀释后, 接种于SOBAG琼脂平板（含氨苄青霉素100 mg/L, 葡萄糖20 g/L）, 以测定转化率, 并随机挑选10个单克隆菌, 酶切鉴定轻链库的重组率。
其余菌液扩大培养后提取质粒, 经Spe I和Xho I双酶切, 回收带有多样性轻链基因的载体大片段; Fd段重链基因也以Spe I和Xho I双酶切后回收, 用T4 DNA连接酶将回收的两种基因片段连接, 将连接产物电转化 E.coli XL1Blue, 其余构建Fab段抗体基因库步骤同轻链基因库的构建。
1.2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选将Fab段抗体基因库的菌液转入SB A+T+液体培养基（含100 mg/L氨苄青霉素和10 mg/L四环素）中37℃振荡培养2 h, 然后按1×1012pfu/100 mL加入辅助噬菌体M13K07和卡那霉素（终浓度70 mg/L）, 于37℃培养过夜。
次日, 将扩大培养的菌液于4℃以4 000 r/min离心15 min, 加入40 g/L PEG8000沉淀, 用含有10 g/L BSA和100 g/L甘油的PBS重悬沉淀, 瞬时离心, 取上清即为噬菌体抗体库。
用纯度为1×1015/L 的Long株RSV颗粒作抗原进行初步筛选, 将RSV包被于96孔板于4℃过夜, 次日, PBS洗涤后, 用30 g/L BSA PBS封闭, 于37℃孵育1 h。
将上述噬菌体抗体库溶液加入96孔板于室温孵育1 h后倒空, 用含0.5 mL/L Tween的PBS洗涤10次后, 再用PBS洗涤10次。
加入对数期生长的E.coli XL1Blue和M13K07, 于37℃孵育2 h以让其再感染和进行噬菌体挽救, 并测定抗体库的滴度, 其测定方法为: 将抗体库按比例稀释后取1 μL与100 μL对数期生长的XL1blue 菌液混合, 37℃缓慢振荡反应20 min, 加入Top Agar 3 mL, 铺至37℃预热不含抗生素的LB琼脂平皿, 37℃培养过夜, 计算平皿上噬斑形成单位（pfu）。
重复上述淘筛过程3遍。
每轮筛选完毕后均按如下过程对抗体库进行ELISA检测: 将100 μL RSV包被于96孔板4℃过夜; PBS洗涤后于每孔加入10 μL待测噬菌体抗体, 并用含20 g/L 脱脂奶的PBS于室温封闭2 h; 加入HRP抗M13抗体孵育1 h; 用PBST洗涤5次, 加入ABTS置室温30 min后测A值。
2 结果2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取提取的总RNA凝胶电泳显示条带完整, A260/A280值为2.03, 说明提取的总RNA质量较好(图1)。
图1 总RNA凝胶电泳分析2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增取适量轻链基因和重链Fd段基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 在约700 bp处均可见扩增条带, 与预期的大小相符（图2）。
2.3 轻链基因库和Fab段基因库的构建及鉴定从轻链基因库14 mL 转化产物中取1 μL稀释后铺于琼脂平板上, 共长出205个单克隆菌落, 从而推算转化子数为205×14×103=2.9×106; 随机挑取的10个菌落的质粒经Sac I和Xba I双酶切后电泳, 其中有8个可得到700 bp左右DNA片段, 为轻链基因插入片段, 重组率为80％, 则其库容量为2.9×106×0.8=2.3×106。
用同样的方法, 得到Fab抗体基因库转化子数为2.6×106, 随机挑取的13个克隆中有9个酶切出Fd段DNA片段, 则重组率为9/13(约70％)（图3）, 则其库容量为2.6×106×0.7=1.8×106。
2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选以RSV作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮“吸附洗脱扩增”的筛选, 测定抗体库滴度分别为 1.2×105、 1.8×106、 9.4×106 pfu, 显示了明显增加的趋势, 第3轮比第1轮增加了78倍, 说明特异性噬菌体得到了富集; 每轮均经ELISA检测, A值分别为0.23、 0.56、 1.05, 随着筛选轮数的增加而逐渐增加。
3 讨论呼吸道合胞病毒感染在儿科很常见, 每年均有暴发, 发病率高, 90%在2岁前均感染过RSV［3］, 但目前尚无理想的抗病毒药物。
1891年, Emil von Behring首次将来自动物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患儿的治疗取得较为满意的疗效, 从而为抗体用于感染性疾病的治疗奠定了基础［4］。
杂交瘤技术的创立, 为mAb用于感染性疾病的治疗提供了可能, 但是鼠源性的mAb因HAMA反应等副作用而受限于临床应用［5］。
噬菌体抗体库技术的出现, 首次为获得完全人源性的mAb提供了一条佳径。
噬菌体展示技术是一种分子多样性技术, 它让大量不同的多肽或蛋白展示在丝状噬菌体的表面［6］。
针对几乎任何抗原的高亲和力特异性抗体均可在噬菌体抗体库中筛选出, 使mAb 用于肿瘤、感染性疾病等的诊断、治疗成为可能［7, 8］。
与费时而繁杂的mAb技术相比, 噬菌体抗体有稳定的基因来源, 可以通过DNA重组, 迅速而经济地制备各种人源性抗体而无动物免疫原性, 从而适合体内诊断与治疗［9］。
有两种途径可以获得高亲和力的抗体, 一种是构建大容量的天然抗体库, 另外就是构建免疫抗体库［10］。
从免疫抗体库中获得的抗体其亲和力较从天然抗体库中获得的要高, 而且无交叉免疫源性。
我们选用呼吸道合胞病毒感染患儿的淋巴细胞作为基因来源, 将减少抗体的多样性, 但可以从相对较小库容的抗体库中获得高亲和力特异性抗体。
通过初步鉴定, 我们所构建的抗体基因库库容量为1.8×106, 经过3轮淘筛, 特异性Fab抗体得到较好的富集。
因此, 我们成功构建了一免疫噬菌体抗体库, 为后续的实验和进一步研究打下了良好的基础, 也将有益于小儿呼吸道合胞病毒感染的诊断、治疗和预防。
【参考文献】［1］ Hoogenboom HR, de Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applications［J］. Immuno Technol, 1998, 4(1): 1-20.［2］李晓琳, 侯宗柳, 刘建生, 等. 超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建［J］. 云南医药, 2006, 27(2): 94-97.［3］ Ogra PL. Respiratory syncytial virus: the virus, the disease and the immune response［J］. Paeditr Respir Rev, 2004, 5(2): 119-126.［4］何维. 医学免疫学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 24-48.［5］ Hughes D. Therapeutic antibodies make a comeback ［J］. Drug Discovery Today, 1998, 3(10): 439．［6］ Clackson T, Lowman HB. Phage display A practical approach［M］. Oxford University Press Uk, 2004: 15-28.［7］ Binyamina L, Borghaei H, Weiner LM. Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies［J］. Update CancerTherapeutics, 2006, 1(2): 147-157.［8］ Kang XP, Yang BA, Hu YY, et al. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display［J］. Clin Vac Immunol, 2006, 13(8): 953-957.［9］ Azzazy HM, Highsmith WE. Phage display technology: clinical applications and recent innovations［J］. Clin Biochem, 2002, 35(6): 425-445.［10］ Bowley DR, Labrijn AF, Zwick MB, et al. Antigen selection from an HIV 1 immune antibody library displayed on yeast yields many novel antibodies compared to selection from the same library displayed on phage［J］. PEDS, 2007, 20(2): 81-90.。