这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。

由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。

在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。

这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。

这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。

TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。

我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。

使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。

3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。

分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。

用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。

通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。

6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。

（1.5-2小时）7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。

8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。

In advance准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理）在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作Steps ProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of libraries第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体B1和B3 制作文库的第二原种Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selection第二天A7-A12 增殖文库I和J，并且制备噬菌体C1 包被第一轮筛选用免疫管Day 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selection第三天C2-C11 第一轮筛选Day 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selection第四天D1-D6 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selection第五天D7-D11 从第一轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第二轮筛选Day 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selection第六天D1-D6 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C1 包被第二轮筛选用免疫管Day 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selection第七天D7-D11 从第二轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）C2-C11 第三轮筛选Day 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISA第八天D1-D6 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体E1 包被多克隆噬菌体ELISA用的96孔板Day 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISA第九天D7-D11 从第三轮筛选的结果中制备噬菌体（继续）E2-E8 多克隆噬菌体ELISA每个克隆的进一步的描述可以通过单克隆噬菌体ELISA（方案E），单克隆噬菌体ELISA用水溶性的scFv 片段（方案F）。

PCR检测（检测插入，方案H）和测序（方案I）1. 将文库的加入到200ml预热的含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基上2. 37°C振荡培养至OD 600为0.43. 从中取50ml，加入2x1011 KM13辅助噬菌体（剩余的150ml在方案B中用来制备文库的第二细菌储存液）4. 37°C水中温浴30分钟5. 3000g,离心10min,用100ml含有100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml的卡那霉素和1 %葡萄糖的2xTY培养基6. 30度振荡过夜培养7. 将过夜产物在3300g离心30分钟8. 取上层液体80ml，加入20mlPEG/NACL(含20 % PEG，2.5 M NaCl)溶液9. 3300g离心30分钟，倒掉PEG/NACL溶液，重新离心，吸去剩余的PEG/NACL溶液10 用4mlPBS缓冲液悬浮沉淀，11600g离心10分钟，去掉任何剩余的细菌残渣11. 短期使用的话可以保存在4℃，长期保存的话置于含有15%甘油的PBS中，-70℃保存。

12. 将噬菌体稀释100倍，然后继续稀释至6个浓度，加入900μl OD 600 为0.4的TG1至每一个管中，37°C水浴30min,取每个稀释浓度的10μl加入到TYE培养基上，其中包含100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖，37摄氏度过夜培养。

浓度在1012-1013/ml，至少可以进行10次筛选1．将A3步骤中剩余的150ml液体，37摄氏度下振荡培养2小时2、10800g离心10分钟，用10ml含有15%甘油的2xTY悬浮3、每管500微升，分装20管，保存于-70℃。

每次制备的时候用其中一管。

这个仅限于你打算做超过10次筛选的时候。

或者，噬菌体可以用生物素酰化的抗原或者亲和层析来完成1、用目的抗原4ml过夜来包被免疫管。

包被的效率取决于抗原的浓度，温度和缓冲液，通常用抗原浓度10-100 μg/ml的PBS缓冲液。

2. 第二天用PBS缓冲液洗三次（倒入管内，然后马上倒出来）3. 用含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液注满管子，室温下孵化，置于工作台上两个小时候停止4. 用PBS缓冲液洗管3次5. 将1012- 1013噬菌体键入到4ml的含有2%的脱脂奶粉的磷酸缓冲液。

室温下旋转培养孵育60分钟，然后静止培养60分钟，弃掉上清液6. 用含有0.1%的吐温20的磷酸缓冲液洗管子10-20遍7. 甩干多余的PBS缓冲液，用含有50 μl of 10mg/ml胰蛋白酶的磷酸缓冲液500微升稀释噬菌体，用可翻滚的摇床室温培养10min.8. 取1.5mlOD值为0.4的大肠杆菌TG1，加入250 μl稀释后的噬菌体（剩余的4°C保存），37℃水浴30min..9. 吸取液体，及稀释100倍的，和稀释10000倍的溶液各10微升，加到含有100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上，37度过夜培养来测定噬菌体10、第一轮筛选时如果用复合抗原，取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。

将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。

如果用的是单个的半抗原，糖类或者蛋白质抗原及所有抗原的下面的步骤：取剩余的TG1培养物，11600g离心5min。

将底部的细菌用1ml的2xTY，涂于大的圆形的Bio-Assay dish，包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的TYE培养基上。

11. 37°C过夜培养第一轮的筛选是最重要的。

任何的错误都会导致以后的错误。

每轮结束后最少能够得到100个火星的噬菌体，如果少于这个数量，说明可能出现了错误。

所以，试着用新鲜的TG1感染剩余的250ml噬菌体，如果这一步仍然少于100噬菌体，从C1开始重复筛选。

1. 过夜增殖以后，加7ml含有15%甘油的2 xTY到large square Bio-Assay dish或者加2ml到常规的培养皿，然后用玻璃涂布器松散细胞，彻底混匀。

将得到的50 μl细菌接种到50 ml包含100 μg/ml 氨苄青霉素、和1 %葡萄糖的2xTY中。

剩余的1ml保存在15%的甘油中，-70°C保存。

2. 振荡培养至OD600为0.43. 取10ml培养物，加入5x1010辅助噬菌体4 37°C水浴30min5. 3000g离心10分钟。

用含有50 ml包含100 μg/ml氨苄青霉素、和0.1 %葡萄糖的2xTY悬浮6. 30°C振荡培养过夜7. 将过夜产物3300g离心10分钟8. 加入10ml PEG/NaCl (20 % PEG 6000, 2.5 M NaCl)至40ml上清液。