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线粒体蛋白定位的实验
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7.3.2 线粒体蛋白定位
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线粒体基质蛋白定位 线粒体膜间间隙蛋白的定位
需要两个前导肽、两种方式: ◆保守性寻靶 ◆非保守性寻靶 线粒体内膜蛋白的定位 线粒体外膜蛋白的定位
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线粒体基质蛋白定位
前导肽
前导肽酶
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• 前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分子伴侣 Hsp70 的帮助下解折叠， • 然后通过N-端的前导肽同线粒体外膜上的受体蛋白识别， • 并在受体(或附近)的内外膜接触点(contact site)处利用ATP水
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7.1 线粒体的形态结构
光镜下形态
大小
直径约0.5~1μm 长度在1.5~3 μ m
线状 颗粒状
故名线粒体
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7.1 线粒体的形态结构
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7.2 线粒体结构与化学组成
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线粒体膜通透性实验
将线粒体放在100 mM蔗糖溶液中，蔗糖穿过外膜进入线粒体的膜间间隙；然后 将线粒体取出测定线粒体内部蔗糖的平均浓度，结果只有50 mM， 比环境中蔗糖的 浓度低。据此推测:线粒体外膜对蔗糖是通透的，而内膜对蔗糖是不通透的
◆ 1900年，Leonor Michaelis 氧化还原反应
◆ 1943年，Arbert Claude 采用盐法分离技术分离到线粒体
◆ 1948年George Hogeboom等采用蔗糖介质分离有活性的线粒体 能 量转换的部位
逐步证明了线粒体具有Krebs循环、电子传递、氧化磷酸化 的作用，从而证明了线粒体是真核生物进行能量转换的主要部位。
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线粒体组分的分离
首先将线粒体置于低渗 溶液中使外膜破裂，此时线 粒体内膜和基质(线粒体质) 仍结合在一起，通过离心可 将线粒体质分离。用去垢剂 Lubrol处理线粒体质，破坏 线粒体内膜，释放线粒体基 质，破裂的内膜重新闭合形 成小泡，其表面有F1颗粒。
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外膜(outer menbrane)
◆标志酶:单胺氧化酶; ◆外膜含有较大的通道蛋白:孔蛋白;
Chapter 7 线粒体和过氧化物酶体
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纲要
7.1 线粒体形态 7.2 线粒体结构与化学组成 7.3 导向信号与线粒体蛋白定位 7.4 线粒体功能:氧化磷酸化 7.5 线粒体遗传、增殖和起源 7.6 过氧化物酶体
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7.1 线粒体的形态结构
线粒体的发现与功能研究
◆1850年，德国生物学家Rudolph Kölliker第一系统的研究了线粒体。 (肌细胞)
解产生的能量进入转运蛋白的运输通道， • 然后由电化学梯度驱动穿过内膜，进入线粒体基质 • 在基质中， 由线粒体分子伴侣Hsp70(mHsp70)继续维持前体
蛋白的解折叠状态。 • 接着在Hsp60的帮助下， 进行正确折叠， • 最后由前导肽酶切除导向序列，成为成熟的线粒体基质蛋白。
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线粒体膜间间隙蛋白保守性寻靶
膜间隙导向序列
基质导向序列
前导肽酶
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◆线粒体膜间间隙蛋白的转运
定位需要两个导向序列，基质导向序列和膜间隙导向序列。这类蛋 白有两种转运定位方式。
保守性寻靶
前体蛋白在N-端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样 的运输方式，将前体蛋白转运到线粒体基质，
在基质中由前导肽酶切除基质导向序列后， 膜间隙导向序列就成 了N端的导向序列， 它能够识别内膜的受体和转运通道蛋白， 引导蛋白质穿过内膜，进入线粒体膜间隙，然后由线粒体膜间 隙中的前导肽酶将膜间隙导向序列切除。
●长约20-80个氨基酸，通常带正电荷的碱性氨基酸(特 别是精氨酸和赖氨酸)含量较为丰富;
●序列中不含有或基本不含有带负电荷的酸性氨基酸， 并且有形成两性(既亲水又疏水)α螺旋的倾向。 有利 于穿过线粒体的双层膜；
●需要消耗能量; ●需要分子伴侣。
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◆前导肽的特异性
●具有细胞结构的特异性 ●前导肽的不同片段含有不同的 信息（双导向序列）
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线粒体膜间间隙蛋白非保守性寻靶
革兰 氏阴 性细 菌外 膜中 的孔 蛋白
ß折叠
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内膜(inner membrane)
◆线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的部位，通透性差; ◆含有大量的心磷脂(cardiolipin)， 心磷脂与离子的不可 渗透性有关; ◆内膜的标志酶:细胞色素氧化酶; ◆按作用分3类酶
①运输酶类 ②合成酶类 ③电子传递和ATP合成的酶类
膜结合核糖体上合成的蛋白质通过定位信号，一边翻译，一边 进入内质网，在翻译的同时进行转运定位， 通过信号肽，经过连 续的膜系统转运分选才能到达最终的目的地，称为蛋白质分选。
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细胞 质核 糖体 的蛋 白质 合成 与去 向共翻译转运 分秘泡来自翻译后转运16
游离核糖体合成蛋白质的去向
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前导肽与信号肽
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膜间隙(intermenbrane space)
◆标志酶:腺苷酸激酶 ◆功能:建立电化学梯度
线粒体基质(matrix)
◆标志酶:苹果酸脱氢酶 ◆功能:进行氧化反应， 主要是三羧酸循环
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线 粒 体 膜 的 运 输 系 统
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线
粒
体
的
钙
调
节
作
系统1是由膜动力势引起的Ca2+离子流向线粒体基质; 系统2是通过与Na+离子的交换将Ca2+离子输出到胞质溶胶。
◆前导肽(leading peptide)
将游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号称为 导向信号，或导向序列，由于这一段序列是氨基酸组 成的肽，所以又称为转运肽。
◆信号肽(signal peptide)
将膜结合核糖体上合成的蛋白质的N-端的序列
称为信号序列，将组成该序列的肽称为信号肽。
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◆线粒体前导肽的性质
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双导向序列
两个导向序列，位于N端最前面的为基质导向序列，其后还有第二个 导向序列，即膜间隙导向序列，功能是将蛋白质定位于内膜或膜间隙
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基质导向序列
膜间隙导向序列
◆如何证明前导肽引导 蛋白质进入线粒体?
P274
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◆实验设计
●分离线粒体 ●与具有线粒体基质定位信号的前体蛋
白温育 ●胰蛋白酶处理
用
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7.3 前导肽与线粒体蛋白定位
◆线粒体各部分的蛋白质来自何方? ◆定位机理如何?
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7.3.1 蛋白质寻靶与分选
蛋白质的两种运输方式
●翻译后转运
游离核糖体上合成的蛋白质释放到胞质溶胶后被运送到不同的 部位， 即先合成，后运输。在合成释放之后需要自己寻找目的地，
又称为蛋白质寻靶。
●共翻译转运