DOC格式论文，方便您的复制修改删减 纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白 (作者： __________ 单位： ___________ 邮编： ___________ )

【摘要】建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。 以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰，在其表面固定特异性蓖 麻毒单抗并作为探针，用于蓖麻毒蛋白的检测。米用场流分离技术对 纳米颗粒探针进行准确表征，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒 的形貌变化。结果表明：通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米 颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失 活蛋白的特异性结合，应用于目标蛋白的检测。 【关键词】 纳米颗粒探针；蓖麻毒素；核糖体失活蛋白；场流分离； 扫描电镜；聚苯乙烯 1引言

核糖体失活蛋白(Ribosome ］inactivating proteins, RIP)存在于 许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用， 即抵抗 病虫害或者恶劣的环境［1］。根据蛋白质的一级结构，RIP可以分成 两类：1型，由一条多肽链组成;H型，是双链蛋白。H型双链RIP由2 条DOC格式论文，方便您的复制修改删减 或者4条多肽链组成，分子量约为60或120 kDa，其中一条是A (Active)链，具有N［糖苷酶活性；另一条是B (Binding)链，这两条链通 过二硫键和非共价键连接［2,3］。蓖麻毒是一种典型的核糖体失活蛋 白，由于蓖麻毒来源广泛，禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒列为最 为严格的控制对［4,5］。因此，开展对蓖麻毒等核糖体失活蛋白的检 测研究具有重要意义［6〜8］。目前，检测核糖体失活蛋白的方法有免 疫分析法和生物质谱法［9〜11］。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表 面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白 检测中［12,13］。场流分离(Field flow fractionation, FFF)是 Giddings 提出的一种新的分离分析理论［14,15］，它将流体与外加场联合作用于 样品，实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中 范围为0.02〜1呵的悬浮物颗粒，也可作为一种表征技术对样品中 纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离 技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁 场等多种分支，其中沉降场流分离(Sedime ntatio n field flow fractionation)技术较为完善且应用较多［16,17］。 本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚 苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗， 利 用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征， 测量出单个聚苯乙烯纳 米颗粒结合的目标分子数目，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒 的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结 合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与核糖体失活蛋白的特异性结合， 可 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 应用于目标蛋白的检测。 2实验部分 2.1仪器与试剂 沉 降场流分离仪(Postnova, UT, USA);Anton Paar DMA (60/602)振动管密度计(奥地利Anto Paar公司);场发射扫描电镜 (LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM, Zeiss, Thornwood, USA); Sputter Coater SC7640 离子溅射仪(Quorum Tech no logies, UK); NAP]5及NAP[10凝胶渗透柱(通用公司);5417C离心机(德国 Eppendrof 公司)。 蓖麻毒素A链(Ricin A Chain,纯度98.99%)及其单抗IgG均 由美国农业部西部研究中心友情提供；聚苯乙烯纳米颗粒(240 nm， 10%，w/V, Bangs Laboratories Inc. PA, USA);NH4HCO3 (99.5%)

、 表面活性剂FL_70(Fisher公司);实验用水为Milli^Q超纯水(18 M Q)。 纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯]聚氧丙烯[聚氧乙烯嵌段 共聚物(F108_PDS)、3(2吡啶二巯基)丙酸N羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和磷酸盐缓冲液，pH 7.4)购自Sigma公 司。 2.2实验方法 2.2.1离心沉降分离检测技术场流分离技术可视为一种单相 的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入 一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)[11〜13]。含有纳米颗粒 悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。 当样品进入通道后，样 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 品将暂停一段时间(即Relaxation time，停留注射或松弛步骤)。此时 样品中的不同组分由于物理性质的差异， 在外加场的作用下，靠近 通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速 差别会导致其相应的保留时间较大的差异， 在流体及外加场的联合作 用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构 [18]及分离原理 如图1所示。 分析化学第38卷第5期全灿等：纳米颗粒探针检测核糖 体失活蛋白 图1 (a)沉降场流分离仪结构图[18]和(b)沉降场流通道分 离原理示意图 Fig.1 (a) Structure diagram of the field _flow fractionation(FFF) system[18]a nd (b) worki ng prin ciple scheme of FFF cha nnel 纟纳米颗

粒在尺度为940 mm X20 mm >0.254 mm的线型光滑通道中进行，该 通道的空隙保留体积为4.49 mL，死体积为0.439 mL，外加场为离 心力场。检测时将线型光滑通道置于离心场中随离心机轴向旋转， 距 离离心机轴的径向距离为15.5 cm。流动相为流速为1.5 mL/min的 0.1% FLJ0溶液。样品进样体积为10山，松弛时间为12 min以确 保样品在分离通道中平衡，离心机转速 500〜2000 r/min，紫外检测 器波长为254 nm。聚苯乙烯纳米颗粒的密度为1.053 g/cm3[19]。利 用振动管密度计测定0.1% FL_70的流动相密度为997.1 kg/m3 [20]。 2.2.2纳米颗粒表面修饰 利用修饰剂F108]PDS对聚苯乙烯表 面DOC格式论文，方便您的复制修改删减 进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂 F108[PDS (10 g/L)加入到聚苯乙烯纳米颗粒悬浮液中，在一定条件 下使聚苯乙烯颗粒表面物理吸附足够量的修饰剂 F108〕PDS，经分离 机离心分离未结合或结合不紧密的修饰剂 F108]PDS ,弃去上清液后 用磷酸盐缓冲液重新稀释纳米颗粒，重复上述步骤3次并合并悬浮液 涡旋混合，取10山纳米颗粒悬浮液样品进行离心沉降分析。 223蓖麻毒单抗表面修饰 利用修饰剂SPDP对蓖麻毒单抗 进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂 SPDP加入到蓖麻毒单抗溶液(2.0 g/L)中，在一定条件下反应后，利 用NAP[5柱分离除去过量的修饰剂 SPDP及一些小分子反应产物， 再加入适量修饰剂 DTT，再利用NAP_10柱分离除去过量的修饰剂 DTT。 2.2.4纳米颗粒固定单抗将端基化的抗体与经表面修饰后的 聚苯乙烯纳米颗粒温和反应，离心除去未结合及结合松散的抗体上清 液，用缓冲盐再次悬浮并涡旋混合，再离心沉淀的纳米颗粒，即得到 具有特异性抗体修饰的纳米探针颗粒，取 10 gL纳米探针颗粒悬浮 液进行FFF分析，测定其表面抗体结合的程度。 2.2.5蓖麻毒蛋白的检测 取5 gL蓖麻毒蛋白，加入到 2.2.4 节制备得到的纳米颗粒探针中，恒温反应。取 10 g-纳米探针颗粒 悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体与蓖麻毒蛋白的结合程度。 2.2.6扫描电镜法 将固含率为1%的聚苯乙烯纳米颗粒悬浮， 液滴在带有碳膜的电镜用铜网上，待悬浮液中的载液用氮气吹干后， 利用离子溅射仪进行离子溅射镀膜，最后将样品放入电镜样品台上进 行扫描电DOC格式论文，方便您的复制修改删减 镜观测。 图2纳米颗粒探针制备机理 3结果与讨论

3.1实验机理 以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异 性单抗，利用离心沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征， 测量出 单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子的数目，实验机理如图 2所 示。由于聚苯乙烯纳米颗粒比表面积大，在溶液中分散性好，本实验 中纳米颗粒的抗原包被、免疫反应均在准均相溶液中进行，反应更充 分，反应物用量更少，反应更完全，可用于痕量、超痕量目标分子的 快速检测。 3.2沉降场流分离法 在2.2.1节的实验条件下，聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流 分离谱图如图3所示，保留时间约为46 min。图3聚苯乙烯纳米颗 粒典型的沉降场流分离谱图 Fig.3 Fractogram from typical FFF analysis of bare polystyre ne(PS) particles

利用沉降场流分离技术测定纳米粒径的原理的报道较多，根据 在外加力场作用下，不同质量的纳米颗粒在分离通道中具有不同的保 留时间进行分离。在一定实验条件下，通过测定的纳米颗粒的保留时 间Tr，计算纳米颗粒的水力学粒径 d,如式(1): R=V0/Vr=6兀coth0.5 入2刀(1)