第十一章植物组织培养.txt你站在那不要动！等我飞奔过去！ 雨停了 天晴了 女人你慢慢扫屋 我为你去扫天下了 你是我的听说现在结婚很便宜，民政局9块钱搞定，我请你吧你个笨蛋啊遇到这种事要站在我后面！ 跟我走总有一天你的名字会出现在我家的户口本上。

第十一章 植物组织与细胞培养☆概念　它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。

一　植物细胞工程☆　植物细胞工程的主要内容◎ 植物细胞、组织和器官的培养◎ 花药培养技术◎ 植物原生质体的制备◎ 植物原生质体的融合◎ 原生质体的摄入实验◎ 转基因植物的制作◎ 染色体（组）的操作技术本章主要介绍植物细胞、组织和器官的培养二、植物细胞工程的发展史1902年，德国植物学家哈伯兰特（G.Haberlandt）最早进行植物细胞培养的试验，被誉为“植物组织培养之父”；1904年， hanning，在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚,最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞工程。

1922年，美国、德国分别报导了离体根尖的培养；1934—1939年，先后发现了各种生长素，并利用番茄、胡萝卜的离体培养，初步建立起较为成熟的细胞培养方法，使植物细胞培养进入一个崭新的时代；1941.荷兰j. van overbeek证明椰子乳汁的活性成分可在体外促进其他种类细胞的分裂和生长。

1943年，美国怀特（White）提出植物细胞具有全能性1948.中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

1954.skoog发现DNA降解物中含有细胞分裂和生长的活性物质。

后被命名为激动素。

50年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作，使细胞培养技术日臻成熟；White、Gautheret、Nobecourt?等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。

?在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。

这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础1960年，Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。

?1971年，Takebe?等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。

1972年，Carlson?等通过两个烟草物种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。

1973年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。

1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株 到目前为止，组织培养、原生质体培养、细胞融合已在许多植物上获得再生成功。

三、?植物细胞工程的任务（1）研究植物器官、组织和细胞在离体培养条件下，所需要的有机营养、无机营养、植物激素等培养条件和刺激因素。

（2）研究植物器官、组织和细胞，在离体培养条件下，所需的温度、湿度和光照等环境条件。

（3）研究植物的不同生理年龄、遗传组成（基因型）在离体培养条件下，形态发生的规律。

（4）研究离体培养条件下再生植株群体的遗传稳定性和变异性。

植物体细胞杂交植物细胞工程所采用技术的理论基础通常采用的技术手段植物组织培养植物细胞的全能性四、植物组织培养在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。

植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性——在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植（一）植物组织培养的发展简史① 探索阶段（19世纪初－30年代中）德国植物生理学家HaHerlandt首次进行了植物细胞培养实验。

提出离体的植物细胞具有发育上的全能性，成为植物组织培养的理论基础。

② 奠基阶段（30－50年代）1934年，White培养番茄离体根尖成功1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功White:烟草种间杂种的瘤组织进行组培Nobecourt：胡萝卜进行组培以上三人是植物组织培养的奠基人③ 迅速发展阶段（60年代后）原生质体，花药，快繁技术迅速发展1958年Steward和Reinert用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚，并进而获得了完整植株。

科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。

人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养（二、）植物组织培养的理论基础1、植物的无性繁殖被子植物的两种繁殖方式：有性繁殖和无性繁殖。

无性繁殖特点：A、不发生遗传重组，后代与亲代在遗传上完全一致；B、可短期内获得大量后代；C、 繁殖方式多样化：营养器官再生、营养器官变态、落地生根等2、细胞的全能性生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。

表现全能性的基础和条件基础： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。

条件：离体，提供营养物质，激素，其他适宜条件（如温度等）在高等动物中，受精卵细胞、早期卵裂细胞、囊胚期细胞具有全能性几乎所有植物的体细胞，雌、雄配子体都具有全能性，都能发育成胚受精卵>生殖细胞>体细胞植物细胞全能性的差异：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 > 居间分生组织> 侧生分生组织 > 薄壁组织(基本组织) > 厚角组织 > 输导组织 > 厚壁组织。

在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官。

当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成愈伤组织（一种相对没有分化的细胞团），继而在植物激素等诱导下发生再分化，才能表达出全能性，发育成完整植株。

3、植物细胞的脱分化和再分化（1）细胞分化细胞分化细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。

它包括：时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。

细胞分化是一个复杂的生物化学过程，有复杂的调控机制。

营养物质和激素的种类和配比能深刻影响分化过程，光照则是许多细胞分化的必需条件细胞的脱分化脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化愈伤组织是细胞脱分化的结果已经脱分化的细胞或组织在一定条件下，它们又可以经过胚状体(由体细胞形成的类似合子胚的结构)或愈伤组织再分化出芽和根，从而发育成一个完整的植株。

激素则是在一定条件下能打破操纵基因的控制，使结构基因活化。

因此，它直接影响和控制细胞的分化。

（2）细胞的再分化和器官发生再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。

高等植物细胞脱分化与再分化示意图（3）植物组织再分化的两条途径，一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。

另一个是在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。

（4）几个重要概念外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

分化〔differentiation〕：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。

再分化〔redifferentiation〕:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。

胚状体〔embroid在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。

（5）影响植物细胞脱分化和再分化因素：内部因子：植物的遗传性状、生理状况。

外部因子：营养条件（植物激素、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的ph、渗透压、温度、湿度、光照等）。

不同程度的影响植物细胞脱分化、再分化及器官建成的各个过程。

愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。

其他影响植物细胞脱分化与再分化的条件物理因素：切割造成的机械和生理隔离，切割创伤产生的物质。

化学因素：化学试剂，辐射处理。

（三） 植物组织培养利用植物组织培养技术可研究被培养部分（外植体）在不受植物其它部分干扰下的生长和分化规律，并可以用各种培养条件影响他们的生长和分化，以解决理论和生产中的问题植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。

1 实验材料的清洗和消毒（1）清洗实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。

（2）消毒清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。

外植体在接种之前，须经严格地灭菌。

由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。

在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。

对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。

表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性剂。

对器官外植体的灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法。

不同器官的灭菌顺序(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次（4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次.一般情况下，如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出需要的茎尖大小培养；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进行相应的外植体消毒。