Ultimate 3000型高效液相色谱仪自主操作培训教材福州大学测试中心2018年9月第一部分Ultimate 3000型高效液相色谱原理和仪器配置一、液相色谱原理简介1、色谱法起源色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

2、液相色谱法的分离原理溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

又称为色层法、层析法。

英文为High Performance Liquid Chromatography，简称为HPLC。

3、HPLC分离模式包括反相模式 (RP-LC)；正相模式 (NP-LC)；离子对色谱 (IPC)；离子交换色谱 (IEC)；体积排阻色谱 (GPC/GFC)；亲和色谱（AC）等。

其中，反相和正相模式又属于液液分配色谱。

•流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。

正相与反相的出峰顺序相反；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。

C-18柱（常用反相柱）。

4、HPLC与经典液相色谱方法以及气相色谱（GC）方法的比较4.1 HPLC与经典液相色谱方法比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。

高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。

可以在数分钟内完成数百种物质的分离。

高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。

4.2 HPLC与GC比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。

流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。

它除了起运载作用外，还可与组分作用，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。

操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。

5、HPLC应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。

可应用于氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。

二、HPLC基本术语和色谱图色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。

基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。

一般应平行于时间轴。

噪音(noise)--基线信号的波动。

通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。

主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。

流出曲线上的突起部分。

正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。

不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。

前者少见。

拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。

也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。

《中国药典》规定T 应为0.95-1.05。

T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。

峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。

峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。

W＝4σ半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。

死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。

即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。

在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。

它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。

其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。

为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

V0＝F×t0（F为流速）保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。

又称洗脱体积。

VR＝F×tR调整保留时间(adjusted retention time，t'R)--扣除死时间后的保留时间。

在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。

t'R＝tR－t0调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)--扣除死体积后的保留体积。

一张色谱图至少能提供以下信息：1 、样品中所含组分的最少个数；2、保留值---定性分析；3、色谱峰面积（或峰高）---定量分析；4、色谱峰的保留值和区域宽度---评价色谱柱的分离效能；5、根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件。

三、HPLC仪器基本配置高效液相色谱仪通常由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据输出系统。

其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。

第二部分Ultimate 3000型高效液相色谱基本操作二基本操作2.1 使用前的准备工作2.1.1 接入稳压电源将稳压电源的输入端插头插在墙上的插孔上。

2.1.2 流动相的更换和过滤1．检查流动相是否太少或放置太久。

超纯水或缓冲盐溶液建议每天必需更换且过滤，以防止长细菌。

超纯水必须为新制，这一点尤其重要。

（市售小瓶装质量好的纯净饮用水也是好的选择）2.梯度洗脱则有机相用一个通道（如A通道），超纯水或缓冲盐用另一个通道（如B通道），使用一段时间建议A和B通道进行更换。

3. 混合流动相的过滤原则：纯有机相或含一定比例有机相的就要用有机系0.45μm的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系0.45μm滤膜。

这一点需特别注意,因有机溶剂可以溶解水系滤膜,被溶解的水系滤膜更易损坏密封圈和柱塞杆。

4. 配好的流动相真空过滤时，当抽滤完后可继续抽滤几分钟，起到抽滤脱气的作用。

2.1.3 流动相的超声脱气1. 过滤后的流动相需要超声脱气约20分钟。

2. 建议超声波中的水位尽量高于流动相瓶中的水位，超声脱气效果会更佳。

3. 超声的时间不易过长，超声波工作会发热，超声时间过久时，超声波中的水会发热，随之流动相也发热升温，导致改变流动相的组成比例。

2.2 打开仪器电源开关打开仪器各部份后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。

各部分自检成功后，方可正常进行以下各步操作。

2.3. 打开软件2.3.1 打开电脑打开电脑，等待约1～2分钟，变色龙服务监视器将会自动启动。

或者双击电脑右下角的变色龙软件的服务管理器，如下图：将跳出如下图所示界面：方能进行以后的各项操作(包括以后用软件控制仪器也需要先激活服务管理器)。

2.3.2 打开变色龙软件双击电脑桌面的“Chromeleon 7”图标，进入变色龙软件。

将出现如下界面：类似电脑操作系统中的资源管理器，左方为根目录，右方为对应目录下的文件夹或文件。

左下方有三大模块：仪器：控制仪器和运行的相关操作界面。

数据：查看和处理仪器分析数据。

eWorkflows：固定工作流程。

单击某一模块，则进入相应的版块。

2.3.3.泵模块连接/断开：软件与泵的连接或断开。

一旦使用软件与泵进行了连接，泵的前面板上的控制键将不起作用。

暂停：仪器暂停时，计时器也暂停但不回到零点，按“继续”键后计时器和泵继续工作。

停泵：泵停止工作，计时器也回到零点。

继续：与“暂停”“停泵”配套使用。

流速/压力：设定泵的流速，压力会自动在线监测。

淋洗液：设定A/B/C/D各通道的比例，通过比例阀调节。

马达：泵和比例阀的开关。

快速清洗功能键。

每天或每次使用仪器分析样品前，需先清洗泵头或管路中残留的气泡或溶剂。

在使用此键前需先向上掀开泵头前面板，然后拧松快速清洗阀（反时针两圈左右）。

然后在软件中按此“冲洗”键，泵将以3.0 ml/min的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停止。

若想手动停止，只要再按“冲洗”键，将停止清洗。

注意：若长时间未使用仪器，或该通道更换了另外的流动相，清洗时间不易太短，一般以5分钟为宜。

否则，有残留气泡或溶剂留在真空脱气机内，易造成流速不稳定，所分析成分的保留时间不稳定而影响正常的分析。

要使用的每个通道（A/B/C/D）都需要设100%A,B,C,D单独快速清洗来排气泡。

如果通过分别设定每个通道的比例让多通道进行同时快速清洗，泵流速建议控制在3ml/min以下，否则容易损坏比例阀。

清洗有缓冲盐的那个通道前后，一定要用去离子水清洗管路和泵头。

以防止缓冲盐直接与纯有机相（甲醇、乙腈等）混合而产生结晶堵塞比例阀。

清洗完毕，先停泵，再拧紧快速清洗阀。

切记：不要在泵未停止清洗前拧紧快速清洗阀。

如下图，为按“冲洗”键前的警告信息。

2.3.4 进样器在U3000仪器控制界面上方的“WPS-3000SL”，将显示下图：位置：三个扇形区分别为；R、G、B。

以分析型自动进器为例，每个区可放置一个标准的分析型孔板和一个大号的孔板。

标准的分析型孔板(2ml)如下图所示：以R区为例，使用该孔板时，样品瓶的位置可定义为RA1-RA8、RB1-RB8、RC1-RC8、RD1-RD8、RE1-RE8，共40个样品瓶位置。

大进样量用大号孔板（10ml）如下图所示：以R区为例，使用该孔板时，样品瓶的位置可定义为R1、R2、R3、R4、R5，共5个样品瓶位置。

体积：RS/SD型的进样器标准注射器为100μl，最大进样量不能超过100μl。