6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌 染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的 性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢 复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞， 本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低 渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失 去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细 胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合 物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物 混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了 很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视 场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且 还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的 观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的 贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深 对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA
实验原理： 利用pMD18-T Vector这个高效克隆PCR
6、重组DNA的鉴定
实验原理： 提取菌体内重组DNA，运用限制性内
切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ对重组DNA进行酶切， 将酶切产物进行电泳，将结果与理论值相 比较
6、重组DNA的鉴定
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
1 min
溶液S1
绿色荧光蛋白的克隆 实验汇报
组员：洪旭伟 唐开强 胡巍然 蔡毅
绿色荧光蛋白简介
绿色荧光蛋白 （GFP）是一种存 在于水母、水螅和 珊瑚等腔肠动物体 内的发光蛋白，其 基因所产生的蛋白 质，在蓝色波长范 围的光线激发下， 会发出绿色荧光。
绿色荧光蛋白简介
绿色荧光蛋白相对荧光素/荧光素酶的优点： 1、发光机理简单 2、光毒性非常弱
5、重组DNA的筛选
实验步骤：
①培养基平板的准备：分别在加有抗生素（氨 苄青霉素(Amp)）和没有加入抗生素的琼脂平板 上加40ul X-gal储存液和4ul IPTG溶液； ②设置对比组及涂布：取转化菌若干与受体菌 液若干，与预先加入的X-gal和 IPTG混合，用无 菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面， 于37°C正面朝上培养，直至菌液完全吸收；
掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定DNA的方法 了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
在提高实验技能的同时，还要注重提高自身的实 验素养以及培养严谨的科学研究态度
实验材料
大肠杆菌DH5a菌株 pMD18-T载体 易瑞质粒小量提取试剂盒
BioWest电泳琼脂糖干粉 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 EB 核酸荧光染料 Takara 6 × 电泳上样缓冲液
250μl 裂解液S2
3. 裂解细胞 颠倒混匀4-6次
室温静置
4. 中和 350μl 中和液S3
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
至出现白色
絮状沉淀
3~5min 5. 过柱分离 12，000rpm
取600μl上清至 30s 吸附柱管
弃滤液
6. 洗柱 12，000rpm
600μl
产物的专用载体，在连接液中短时间对目 的基因与载体进行连接
3、构建重组DNA
实验步骤：
①在微量离心管中配制下列DNA溶液：
pMDTM18-T Vector 0.5μl
Insert DNA
1μl
dH2O
3.5μl
②加入5 μl（等量）的 Solution I。
③16℃反应45分钟。
4、重组DNA的转化
Takara EcoRI 限制性内切酶 Takara Hind III 限制性内切酶 Takara 10 × M 酶切缓冲液
实验仪器
恒温摇床 台式高速离心机 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪 水浴锅
1、含目的基因质粒的提取
2、PCR扩增目的基因
实 验
3、构建重组DNA
步
4、重组DNA原理：
PCR由变性—退火—延伸这三个基本反应 构成： ①模板DNA的变性，即加热使DNA双链解离为 单链； ②退火降温后，引物与模板DNA单链配对结合； ③DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作 用下，合成一条新的与模板DNA链互补的复制 链。经过2～3小时的扩增，目的基因就能扩增 几百万倍
42℃水浴 90秒
勿 动
涂板 培养过夜
加入800l LB培养液 37℃振荡培养45分钟
冰浴1-2分钟
5、重组DNA的筛选
实验原理：
载体DNA控制产生的产物α-肽与宿主菌 染色体上的DNA控制产生的产物ω-肽，结合 为具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。在 诱导剂IPTG的作用下，细菌可产生蓝色菌落。 当外源DNA插入到载体质粒的多克隆位点后， 无法形成具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白 质，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落
1 min
溶液S1
250μl 裂解液S2
3. 裂解细胞 颠倒混匀4-6次
室温静置
4. 中和 350μl 中和液S3
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
至出现白色
絮状沉淀
3~5min 5. 过柱分离 12，000rpm
取600μl上清至 30s 吸附柱管
弃滤液
6. 洗柱 12，000rpm
600μl
30s 弃滤液
洗涤液W
7. 洗脱
取吸附柱至 50μl 56℃预热 另一新EP管 洗脱液
600μl 洗涤液W
12，000rpm
10，000rpm
30s 弃滤液 2 min
空柱
室温静置 1min
12，000rpm
1 min 收集洗脱液备用
1、含目的基因质粒DNA的提取
电泳结果：
结果分析：
2、PCR扩增目的基因