铁皮石斛的组织培养研究专业班级：姓名：学号：课程：植物组织培养目录摘要 (3)Abstract (4)前言 (5)1.培养基 (6)1.1配方 (6)1.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例） (6)1.3灭菌 (8)2.转接 (9)2.1转接前准备 (9)2.2转接 (9)2.3培养 (9)3.炼苗 (10)3.1炼苗目的 (10)3.2炼苗方法 (10)4.移栽 (11)4.1基质选择 (11)4.2移栽技术要求 (11)5.结论与分析 (12)参考文献 (13)摘要铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw．)多年生草本植物。
铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。
铁皮石斛是传统名贵中药材，有生津益胃、清热养阴和清咽利嗓等功效，主要药用成分石斛多糖是一种免疫调节剂。
铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。
为了保护和有效利用铁皮石斛，通过组织培养技术大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。
关键词：铁皮石斛组织培养移栽培养基转接快速繁殖AbstractDendrobium orchid Dendrobium is a perennial herb. It is the ultimate in DendrobiumSw,named for its ferric green epidermis.As a rare traditional Chinese herbal medicine,it contributes to dry dampness and strengthen the spleen,clear away lung-heat ,nourish yin ，clear away heat ,and so on.The main medicinal components of Dendrobium polysaccharide is a kind of immune modulators.When mature,its capsule cracks,in which seeds are in small particle size and have a low rate of natural reproduction.In order to protect and utilize the Dendrobium orchid Dendrobium ,it is particularly important to establish a rapid propagation by the tissue culture technique .key words:Dendrobium orchid Dendrobium tissue cultureculture medium adapter rapid propagation前言多年生草本，具有气生根。
茎直立丛生、高30-50cm，肉质稍扁，有节、有槽沟，黄绿色。
单叶互生，叶片革质，无柄，狭长椭圆形或近披针形，叶鞘抱茎。
总状花序腋生，每个花序有花2-3朵，白色，先端淡紫红色。
铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物。
作为我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值。
由于长期过度采挖,加之本身繁殖率低,导致其野生资源急剧减少,日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物,成为国家重点保护的药材品种。
试验结果表明,MS、N6和B5等3种基本培养基对铁皮石斛芽诱导和增殖的效果, B5要优于其他基本培养基;在激素浓度配中,铁皮石斛原球茎在6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L中,增殖系数最大;天然附加物对铁皮石斛增殖的影响差异很大,实际应用中宜选用香蕉汁为添加剂;在B5+蔗糖30g/L+香蕉汁100mg/L+琼脂5.8g/L基本培养基中,加入的NAA对铁皮石斛芽的生根以1.0mg/L 处理的效果最好,但考虑到NAA价格较贵,且在浓度范围为0.2-1.0之间对生根的影响差异不明显,在实际应用中以选用0.2mg/L的NAA为好;生成的小苗经过炼苗后,在铺有一层苔藓的含有75％锯末+20％泥炭土+5％碎磁片的基质上能够良好的生长。
1.培养基1.1配方根据不同阶段，培养基配方有所差异。
如表1-1表1-1 各种培养基配方不同阶段培养基备注愈伤组织（原球茎）的诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8原球茎的增殖MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂pH =5.8原球茎的分化MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8幼株的生根壮苗MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.4-5.61.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例）配方：10%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA 1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA（0.1mg/ml），混合均匀；5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。
分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。
培养基附加物：（1）天然添加物在基本培养基中加人香蕉汁、马铃薯汁、绿豆芽汁、苹果汁仁、椰子乳等能促进铁皮石斛幼苗的生长和根系的发育，香蕉汁的促进作用最为显著。
（2）炭源铁皮石斛在生根培养时加入活性炭有利于试管苗的生长，能使根系长得更加粗壮闭。
唐桂香等认为在培养基中添加活性炭有助于提高试管苗的成活率，但对苗的根数和根长影响小。
注意事项①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；③煮沸时，小心溶液溢出；④分装时不要污染培养瓶瓶口。
1.3灭菌1.3.1培养基灭菌1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；6）关闭电源，使之自动降温至0℃。
10min后，打开排气阀和锅盖；7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。
表1-2 灭菌时间统计阶段单锅灭菌（耗时64min）多锅连续灭菌第一锅（耗时63min）第二锅（耗时46min）起始22:218:04 9:30排气22:418:23 9:43T=121℃22:508:32 9:50关闭电源23:10 8:52 10:10气压降至0 23:25 9:07 10:161.3.2外植体灭菌①原材料清洗选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2 节为一段放入500ml 的烧杯中，加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。
主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。
②材料二次消毒灭菌将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌: 将茎段腋芽的苞叶拨去。
70% 的酒精速浸25s，用0.1%的升汞溶液浸泡10min 用无菌水冲洗5 次，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，以去掉表面药物残留。
2.转接2.1转接前准备1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；2.2转接1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。
注意事项①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。
2.3培养石斛组培常用的温度为(26±1) ℃光强1 600～2 000 lx日照光8~12h/d（1）组培苗在光照度为2000lx ，温度以22 ℃为宜。
(2) 在20 一22 ℃时丛生芽增殖较好，温度超过25 ℃丛生芽就开始分化成苗。
待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养。
培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。
3.炼苗3.1炼苗目的炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。
3.2炼苗方法1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天；方法（整个过程：适应期，半开瓶期，开瓶期，出瓶，洗根，浸泡，移栽或框炼并移栽）。
4.移栽4.1基质选择栽培的基质为火山岩1+椰衣2+木炭1的基质配比石斛兰长势最好，椰衣1+水苔1和块状椰衣的基质配比稍微次之。
多数树皮中含有较多的酚类物质，这对于植物是有害的，而且树皮的C/N比值都较高，直接使用会引起微生物对速效氮的竞争作用，造成N素缺乏，树皮保水性能差。
4.2移栽技术要求将已经灭菌地石斛茎段，在无菌条件下切成至少带有一个茎节地茎段，接种于事先准备好的诱导芽培养基中诱导出芽。
从茎尖或茎段培养得到的小苗，大多数是无根小苗，需转入1／2MS加马铃薯进行生根和壮苗培养，才能出管移栽。
铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。
移栽后隔5天再浇水效果较好。
30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。
4.3移栽后期管理营养生长期施用氮肥较高的花多多复合肥（N:P:K=30:10:10），花芽分化期开始施偏重磷钾肥（N:P:K=10:30:20），其余时期施（N:P:K=15:20:25）以促进假鳞茎的生长，采用“薄肥多施”的原则，施肥频率为1次／1周，浓度为0.1%叶面喷施，雨天不施肥。