2021年胆曩癌相关基础研究现状与展望(全文)摘要胆囊癌是胆道系统常见恶性肿瘤，其恶性程度高，早期诊断困难，根治性切除率低，放化疗等现有综合治疗效果不理想，预后极差。
因此,加强胆囊癌相关基础与临床转化研究具有重要意义。
应加强在胆囊癌领域的多中心合作，进一步完善生物样本、临床病理学、预后及生物信息等多维度的大数据平台建设，结合数据分析手段,以期实现胆囊癌的早期诊断,个体化精准评估与治疗。
胆囊癌(gallbladder carcinoma , GBC )是胆道系统常见恶性肿瘤, 其恶性程度高、早期诊断困难，70%-80%的病人发现时已为晩期，放化疗等综合治疗效果不佳，预后极差,5年生存率仅5%~ 15%［ 1 ］。
因此，加强胆囊癌的基础研究，以期提高其临床诊治水平,是改善胆囊癌病人预后的关键。
本文阐述胆囊癌的基础研究现状和进展，为胆囊癌的基础与临床转化研究提供思路。
1 流行病学概述胆囊癌是一类起源于胆囊上皮的恶性肿瘤，其发病率在消化道恶性肿瘤中排第六位，具有明显的地理分布特征，全世界总体发病率约2/10 万左右［2 ］。
其中南美的玻利维亚、智利、ED度北部、东欧，以及一些东南亚国家发病率较高［3 ］。
我国的总体发病率约为3.82/10万［4 ］,其中上海市发病率可至7.8/10万,近年来我国的发病率不断上升，引起了越来越多的关注［5 ］。
胆囊癌恶性程度高，病死率占所有癌症导致死亡的1.7%。
研究表明，性别、种族、肝胆管结石、细菌感染、饮食以及环境暴露等均为胆囊癌发生的危险因素［2 ］。
我们回顾了我国10个省、15家医院的3528例胆囊癌的临床资料，发现我国胆囊癌5年总体生存率为23%，确诊时多半为晩期，且在可切除的病人中,40.2%病人为术中确诊，同时胆囊癌对现有的放化疗及靶向冶疗不敏感，缺之有效的综合治疗手段［1-2 ］。
因此,深入开展胆囊癌基础硏究,系统研究胆囊癌发生发展的分子机制、新技术的应用、类器官模型建立、肿瘤免疫等,将对胆囊癌的诊治大有裨益。
2 胆囊癌发生发展的分子机制肿瘤的发生被认为是一个长期的多因素参与的多阶段过程,是环境与遗传因素共同作用的结果。
随着分子生物学的发展，学术界对胆囊的认识从解剖、组织胚胎、病理学等宏观层面深入至细胞、分子、基因等微观层面，更加深入的阐明其发生发展机制，为临床转化提供硏究基础。
本课题组通过对57对胆囊癌及癌旁样本进行全基因组外显子及靶基因深度测序，在国际上首次构建了胆囊癌突变谱，发现了TP53 (47.1% )、KRAS ( 7.8% )、ERBB3 ( 11.8% )等基因呈现显著的非沉默突变；首次发现胆囊癌ErbB信号通路发生高频突变(36.8% ), 且与病人的不良预后呈显著正相关。
另外也有报道胆囊癌中存在KRAS、CDKN2A/B. TP53、p16、MUC1、VEGF、COX-2、HMGA2 等基因突变,且与胆囊癌侵袭转移密切相关［2,6-8］。
由此可见，体细胞基因突变造成的癌基因激活与抑癌基因失活在肿瘤的发生发展过程中扮演舂至关重要的作用。
因此，对于胆囊癌体细胞突变筛查有助于发掘其发病的驱动基因。
我们基于前期研究基础，现已开展一项胆囊癌靶向ERBB2相关临床试验，有望改善胆囊癌目前尚无有效靶向药物的困境。
表观遗传在胆囊癌的发生发展中同样发挥舂重要作用。
其中, DNA甲基化在肿瘤发生时常出现，从而导致基因组功能的丢失［9 ］。
研究结果表明，胆囊癌的抑癌基因甲基化异常増高，并且与病人生存密切相关［10 ］。
笔者团队研究发现，NOP2/SunRNA甲基转移酶2 可通过相互作用伴侣RPL6促进胆囊癌的进展［11 ］。
另外，非编码RNA对胆囊癌发生发展的作用近来也受到了关注。
我们的硏究结果表明,miR-122通过干扰PKM2的表达抑制胆囊癌的増殖，MALAT1 通过激活ERK/MAPK 通路促进胆囊癌的增殖和转移JncRNA-HGBC 通过激活miR-502-3p-SET-AKT级联反应促进胆囊癌的转移［2 , 12］o因此，在研究基因本身改变的基础上,关注基因的修饰（包括甲基化等）、转录过程的调节（包括转录因子、microRNA、IncRNA、cirRNA. piRNA等）、蛋白质翻译（包括蛋白质的棕搁酰化等），为胆囊癌的分子机制硏究提供了新的思路。
3 新技术的应用随舂数学、物理学、化学、信息工程等基础科学的发展，以及相关学科与生命科学的交叉，医学领域近年来兴起了一批新的技术，给胆囊癌的基础与转化硏究带来了一些新的方向。
3.1 测序技术测序技术发展至今，包括以Sanger法［13 ］为代表的一代测序技术，因其精确度极高，目前仍视为全标准，但其通量较低、成本较高，尚未能在临床上推广应用。
第二代测序技术［14 ］以高通量为主要优势，成本大幅降低，目前在临床的应用较为广泛。
我们利用二代测序在国际上率先描绘了胆囊癌突变谱，并发现ErbB 信号通路在胆囊癌发病机制中的关键作用［8 ］。
Chiu等［15 ］通过对多伦多和中国香港两个中心的胆囊癌石蜡包埋样本进行二代测序，发现胆囊癌常见的突变TP53 , SMAD4等,与笔者的前期报道基本吻合,相关硏究结果为胆囊癌的精准诊断与靶向治疗的选择提供了实验基础。
Tsuchiya等［16 ］通过宏基因组测序探究了胆囊癌和胆石症病人胆囊中的微生物菌群变化，在病人的胆汁样本中均检出了大肠杆菌。
我们也通过对7对配对的人胆囊癌和慢性胆囊炎样本进行宏基因组测序发现，两组间胆汁微生物组成和基因功能方面表现出明显差异,其中产气链球菌和粪肠球菌可能在胆囊癌发生进展中发挥一定的作用，为胆囊癌的菌群治疗提供了可能的靶点［17 ］。
随着精准医学理念的提出，目前，基于二代测序的液体活组织病理学检查(液体活检)，个体化药物筛选与靶向治疗等临床转化硏究正成为热点，并且多项相关临床试验已经提示了较好的诊断与治疗效果。
Kumari等［18 ］发现循环游离的DNA( cfDNA )在诊断胆囊癌时具有很好的灵敏度与特异度，可用于胆囊癌的早期诊断。
我们根据前期的研究基础，开展了—项基于液体活检的胆囊癌靶向治疗临床试验，前期部分结果显示经过血浆及穿刺组织测序后发现特定基因突变的晩期胆囊癌病人经靶向联合化疗治疗，部分病人取得了完全缓解并实现了转化，但是总体试验结果报道需待全部临床试验完成后进一步分析。
由于二代测序的读长较短，序列拼装时可能会引起扩增偏倚，对大片段的变异不敏感，三代测序应运而生。
三代测序技术具有读长较长,避免扩增偏倚,较高的灵敏度与特异度等优点，在基因组，转录组等研究中均有应用。
我们目前开展了一项胆囊癌相关三代测序的硏究,希望能够发现胆囊癌新的染色体结构变异，进一步了解肿瘤表观修饰的变化,以及RNA 修饰的改变对肿瘤发生发展的影响。
另外近年来Hi-C测序技术，单细胞测序，空间转录组测序技术等在肿瘤的硏究中兴起，通过进一步探索染色质互作的空间结构，肿瘤组织中细胞类群以及细胞与细胞之间的关系，并将空间信息与形态学结果结合绘制基因表达发生的位置，有望解决肿瘤的空间与时间异质性,为肿瘤的发生发展及肿瘤微环境的硏究提供了新的手段。
笔者认为,通过结合上述新兴技术在胆囊癌中开展应用研究，有望进一步深入硏究胆囊癌的发生发展与侵袭转移的机制，为后期临床转化硏究提供选择。
3.2 纳米技术纳米技术是指硏究尺寸大小在1 ~ 1 50 nm之间材料性质和应用的一种技术,近年来其在生物医药领域应用比较广泛，具有缓释、靶向、生物可降解等特性。
纳米材料在胆囊癌相关的应用主要包括诊断方面纳米级造影剂的应用，治疗方面主要包括纳米级药物以及药物传输系统的设计。
Acevedo等［19］设计了载没食子酸的纳米材料可改善胆囊癌的化疗耐药性，增强治疗作用。
阿霉素和自噬抑制剂氯嗟可増强纳米材料对胆囊癌细胞的光热治疗作用。
笔者团队研究发现，CLIC1抗体修饰的纳米级造影剂可提高胆囊癌影像诊断的敏感度与特异度［20 ］,通过含硒的纳米载药系统可靶向胆囊癌发挥治疗作用［21 ］。
上述结果为胆囊癌的临床诊治提供了新的思路，但仍需进一步临床试验的验证。
3.3 生物信息学技术得益于社会经济水平的发展，大数据与人工智能等信息技术目前在肿瘤中的应用日益广泛。
Tsilimigras等［22 ］基于美国国家癌症数据库,应用机器学习技术分析了胆囊癌病人术后需要检查的淋巴结最小数量和最佳范围，硏究发现与现有指南推荐的6枚淋巴结相比，至少4枚淋巴结的评估可能是更合适的临界值，与病人的最佳结局和分期相关。
Kalra等［23 ］通过检索TCGA数据库, 运用人工智能技术，对门000例泛癌病人的病理学图片进行分析，发现可帮助病理学家判读病理切片,以提高诊断的准确性。
目前，笔者团队联合全国数十家三级医院，建立胆囊癌的单病种数据库，收集病人的临床资料、包括病史、诊治经过、手术记录、病理学资料、检验检查结果，随访资料等，为进一步研究胆囊癌的病因、危险因素、诊治方式的选择等提供较好的硏究平台［1 ］。
同时在进一步建设过程中，配套建立了生物样本库，保留了病人对应的测序等生物信息数据。
相信随舂信息技术进一步发展，基于大数据基础上，如通过机器学习与人工智能的应用，有望实现胆囊的早期诊断，精准分子分型等，为胆囊癌的诊治带来新的指导。
4 类器官模型类器官(organoids )是一种新型的由干细胞分化而来的体外三维细胞培养的复合体，其与来源器官有相似的空间形态结构与功能特征，而且能够在体外稳定扩増。
在肿瘤硏究中,将组织在体外培养形成类器官，可较好的保留肿瘤细胞在体内的形态学、基因组学等信息，更加有效反映原代肿瘤的组织病理，异质性等特征。
类器官在肿瘤的组织分化、细胞间关系、组织空间结构、药物筛选等基础硏究方面具有广阔的应用前景。
目前，肝癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤的类器官已建立，Saito等［24 ］建立了人肝内胆管癌、胆囊癌和壶腹部肿瘤的类器官，并应用于药物的筛选实验。
Erlangga等［25 ］建立了鼠源性的胆囊癌类器官模型并用于伊立替康脂质体的疗效评价。
笔者团队目前也在开展人胆囊癌类器官的建立工作，将对胆囊癌的组织空间结构研究，以及药物筛选等提供新的手段，也是胆囊癌基础硏究的重要方向之一。
5 肿瘤免疫肿瘤免疫治疗(tumor immunotherpy )在多种肿瘤的治疗中取得了突破性进展，被认为有望与放化疗等一起列为新的有效综合治疗手段。
肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂，细胞免疫治疗、肿瘤疫苗等手段。
免疫检查点指肿瘤细胞和（或）免疫细胞上的表达的蛋白分子，阻断免疫检查点可促进T淋巴细胞的激活，重建抗肿瘤免疫。
目前硏究较多的免疫检查点有PD-1. PD-L1. CTLA-4等［26 ］。