第一章绪论基因工程概念：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性。

，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。

（又称遗传工程或DNA重组技术）（一）基因工程研究发展史现代分子生物领域理论上的三大发现：1.DNA是遗传物质2揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制3遗传密码的破译、遗传信息的传递方式。

现代分子生物领域理论上的三大发明：1.限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割2DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3基因工程的载体的发现研究。

（二）基因工程研究内容1目的基因的研究获得目的基因的途径很多，主要有通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。

2基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA连接酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。

现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA 连接酶。

第二章基因工程基本技术路线基因工程基本技术路线图（一）DNA的组成和结构生物体内的DNA绝大部分是以B-DNA形式存在的。

当变性的DNA迅速降温时，两条单链DNA不易复性成双链DNA。

几乎所有真核生物的染色体DNA都是线性DNA，部分原核生物的染色体DNA也是以线形存在。

ocDNA lDNA ccDNA(电泳方向：由上至下)（二）天然DNA的制备1天然DNA的来源：1染色体DNA 2病毒和噬菌体DNA 3质粒DNA 4线绿体和叶绿体DNA2天然DNA的提取：1准备生物材料 2裂解细胞：对于细胞结构简单的原核生物，可用溶菌酶处理，用NaOH和SDS处理，用煮沸处理，用冰冻处理，以及用超声波处理等。

3DNA的纯化：最常用的是方法是乙醇沉淀4 DNA浓缩：5 DNA片段大小的凝胶电泳检测影响电泳的因素：1带点泳颗粒的物理性状2支持物介质3电场强度4缓冲液离心强度凝胶电泳：在PH8..0--8.3的缓冲溶液中，核酸分子带负电，向正极移动。

在浓度适当的凝胶中，由于分子刷选效应，使大小和构想不同的核酸分子迁移率出现差异，从而把它们分开。

6核酸分子杂交（297-312）7DNA序列分析（1）DNA的双脱氧链终止序列（329）（2）化学降解测序列（327）（3）PCR测序（4）DNA自动化测序（5）DNA杂交测序（6）DNA片段序列测序的策略随机克隆策略、引物步移策略和定向缺失克隆策略。

大规模基因测序的两种策略：逐步克隆法和全基因组散弹法第三章基因工程的酶学基础（一）限制性核酸内切酶和DNA片段化1限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

2限制性内切酶识别序列：（1）长度，4--8个碱基，最常见的为6个碱基。

（2）识别序列的结构：大多数为回文结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置，也有序列埠对称的，或呈间断对称。

（3）切割位点：磷酸二酯键断开的位置。

3限制性内切酶内切产生的末端：（1）匹配末端：识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后产生的末端，亦即黏性末端。

（2）平末端：在回文对称轴上同时切割DNA的两条链则产生的末端。

（3）非对称突出末端：识别序列为非对称性时。

4影响限制性内切酶活性的因素：（1）DNA纯度：存在pro、乙醇、EDTA、SDS 等等会降低活性，可增加酶的用量。

（2）DNA样品的甲基化程度。

甲基化对酶切得影响：a修饰酶切位点b产生新的酶切位点c对基因组作图的影响。

（3）限制性内切酶缓冲液的性质：高盐、中盐和低盐。

（4）DNA的分子结构：线形>超螺旋和环状。

（5）酶切温度T：37°5一些限制性核酸内切酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列，这样的限制性核酸内切酶被称为同裂酶。

同裂酶可以是具有不同的切割位点，也可以是具有相同的切割为点。

6 Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。

Star活性出现的频率因采用的限制性核酸内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同。

几乎所有的限制性核酸内切酶都具有Star活性。

7 DNA分子片段化：（1）单酶切法（最常用的方法）（2）双酶切法（3）部分酶切8 DNA分子的限制性图谱：（1）双酶切法（2）部分酶切法（3）Bal 31 逐步切割片段法（二）DNA连接酶1 DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。

但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

2 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

3 T4噬菌体DNA连接酶更广泛的应用：（1）修复双链DNA上的单链缺口（2）连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，后者反应速度较慢。

（3）连接酶完全断开的两个平头双链DNA分子，属于分子间连接，但速度慢，需高浓度的底物和酶。

4 DNA片段的连接：（1）具互补黏性末端片段之间的连接（注意连接前后识别序列的变化）（2）具平末端DNA片段的连接（3）DNA片段末端修饰后再进行连接（4）DNA片段加连杆后连接。

（三）甲基化酶Dam甲基化酶：修饰GATC序列中的腺嘌呤残基成为5’-甲基腺嘌呤。

Dcm甲基化酶：修饰CC(A/T)GG序列中的胞嘧啶残基成为5’-甲基胞嘧啶。

（四）其他酶1 磷性磷酸酯酶2 DNA聚合酶（1）大肠杆菌聚合酶（2）T4噬菌体DNA聚合酶（3）Tt噬菌体DNA 聚合酶（4）耐高温DNA聚合酶：主要用于多聚酶链式反应（PCR）（5）反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。

（6）末端脱氧核苷酸转移酶第四章基因工程载体（一）载体的功能与特征1 概念：载体是在基因工程中，把外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。

2 功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞（2）为外源基因提供复制能力或整合能力（3）为外源基因扩增和表达提供条件3 载体蓝本：天然存在的质粒，噬菌体，病毒DNA，对其再进行修饰、改造、构建成多种功能的载体DNA分子。

4 载体具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有较高的外源DNA装载能力具有多种单一的限制性内切酶的识别位点、切割位点具有合适的刷选标记载体的安全性载体的本质是DNA与外源基因连接导入的受体细胞并能复制进行表达。

5 载体的分类：根据来源和性质分类：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体载体。

根据功能和用途分类：克隆载体、表达、测序、转化、穿梭、多功能载体（二）质粒载体1质粒的基本特征：自主复制、不相容性、可扩增、可转移和不相容性。

质粒载体的三种共同成分：复制起点、刷选标记和克隆位点（一般人工构建的质粒是单复制子）2质粒载体的改造与构建：天然质粒的局限性质粒载体必备条件：具有复制起始位点、抗性基因、多克隆位点和较小的分子量（易于操作）和较高的拷贝数（可以获得大量的克隆基因）质粒载体改造与构建的指导思想常见质粒载体类型：克隆质粒载体、表达质粒载体、多功能质粒载体和穿梭质粒载体。

蓝白斑刷选原理3 质粒DNA的提取4 质粒载体的稳定性（三）λ噬菌体载体1 λ噬菌体的生物学特性2 λ噬菌体的构建（1）野生型λ噬菌体的局限性（2）λ噬菌体的构建3 λ噬菌体的主要类型：插入型取代型4 λ-DNA的提取5 λ噬菌体载体的应用：基因文库与cDNA文库的构建6 λ噬菌体作为载体的优点：刷选方便提取方便7 基因工程克隆策略：分、切、接、转、刷、增8 λ噬菌体载体的克隆步骤：（1）通过裂解过程增值载体（2）载体与外源DNA的酶切（挑选目的基因）（3）载体与外源DNA的连接（4）重组噬菌体的体外包装（5）包装噬菌体颗粒的感染（6）刷选（四）粘性载体（柯斯质粒载体，cosmid载体）1cosmid载体的构建：1978发明了柯斯质粒载体，具有cos位点的质粒概念：是一类有人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体（复制起点、抗性标记、cos位点）具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆的优点，有31-45kb的装载能力。

而且能够被包装成具有感染性能力的噬菌体颗粒。

2cosmid载体的特点：（1）具有λ噬菌体的特征，不形成溶菌周期（以大肠杆菌形式表现而不是噬菌斑）（2）具有质粒载体的特性（3）具有高容量的克隆能力3使用cosmid 克隆载体的基本程序Cosmid 载体的缺点：（1）载体片段自我连接（2）外源DNA 的自我连接（3）多个本来不在一起的外源DNA 连接起来，同时插入与载体上。

（五）单链丝状噬菌体载体1生物学特性（1）外形呈丝状（2）由外壳蛋白和正DNA 组成（3）全长6407个核苷酸（4）至少有10个基因2 构建：p116（六）人工染色体载体146-147（七）噬菌体载体及其他病毒载体第五章 目的基因的获取1目的基因：需要研究的基因2目的基因的制备：（1）直接分离法：限制性核酸内切酶酶切分离法基因分离的物理化学法双抗体免疫发分离编码蛋白的基因利用酶促反转录法直接从特定的mRNA 分离基因（2）构建基因组文库分离法DNA 文库：消减杂交文库、表达库、cDNA 文库基因组文库的概念：某种生物的基因组的全部遗传信息，通过克隆载体贮存在一个受体细胞的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。

若这个群体含贮存某种生物的基因组部分遗传信息，称为部分基因组文库。

建库的基本步骤：基因组文库的大小：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长构建基因组文库：基因组DNA的分离制备基因组DNA的片段化载体制备重组连接噬菌体体外包装转化宿主文库扩增、保存刷选（3）cDNA文库的构建及目的基因的分离某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。

cDNA文库与基因组文库的区别：①基因组文库克隆的是任何基因，它包括未知功能的DNA序列cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因②基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和启动子cDNA文库克隆的是不含内含子的基因③基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空限制cDNA文库克隆的是不完全编码的DNA序列，受发育和调控因子的影响④基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的研究表达，但是它们对于真核细胞基因结核的分析。