免疫学检测方法免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。

随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。

免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。

本章将从抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子检测等方面概括介绍试验的基本类型、原理和主要用途，并对分子生物学技术(分子杂交、转基因、多聚酶链反应)在免疫学领域的应用作一简要介绍。

第一节检测抗原抗体的体外方法抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。

试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。

一、抗原抗体反应的特点(一)抗原抗体结合的特异性抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。

同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。

(二)抗原抗体结合的可逆性抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。

解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。

抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。

(三)抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性抗原与抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例。

若比例合适，则可形成大的抗原抗体结合物，出现肉眼可见反应现象；反之，虽能形成结合物，但体积小，肉眼不可见。

由于这种分子比例的差异，分别形成了三种区带现象。

等价带表示抗原与抗体比例最合适，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体；抗体过剩带(前带)和抗原过剩带(后带)皆表示抗原与抗体的比例不合适，所形成的结合物少且小，其反应体系中存在着游离的抗原或抗体。

抗原抗体分子的比例与结合物大小的关系如图18.1所示。

小分子可溶性抗原，因其表面积大，容易导致后带现象；而细胞等颗粒性抗原，在与抗体反应时则易出现前带现象。

因此在抗原抗体检测中，为能得到肉眼可见的反应，在了解抗原的物理性状之后，对抗原或抗体进行稀释，以调整二者的比例。

图18.1抗原-抗体反应模式图(四)抗原抗体反应的阶段性抗原抗体反应可分为两个阶段。

第一阶段是抗原抗体的特异结合阶段，此阶段仅需几秒到几分钟、尚无可见反应；第二阶段为可见反应阶段，需数分钟、数小时乃至数日，受各种因素影响。

二、抗原抗体反应的主要影响因素(一)抗原和抗体浓度、比例抗原和抗体浓度、比例对抗原抗体反应影响最大，是决定性因素，如前所述。

(二)电解质抗原与抗体特异性结合后，其亲水性减弱，分子表面所带的电荷易受电解质影响而失去，复合物间的排斥力下降，导致第一阶段已形成的可溶性结合物能进一步联结，出现明显的凝集或沉淀现象。

试验中常用0.85％的NaCl溶液作为稀释液，以提供适当浓度的电解质。

(三)温度适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加速结合物体积的增大，一般而言温度越高，形成可见反应的速度越快，但过高则会使抗原或抗体变性失活，影响试验结果。

一般在37℃下进行试验，但也有些抗原抗体在4℃下进行反应较好。

(四)酸碱度pH过高或过低都将直接影响抗原或抗体的理化性质。

例如，当pH降至3.0左右时，因接近细菌抗原的等电点，细菌表面蛋白或其他基团所带的电荷消失，其相互间的排斥力丧失而导致非特异性酸凝集，影响试验的可靠性。

三、抗原与抗体的制备抗原与抗体是血清学反应的物质基础。

抗原的制备与纯化是获得特异性抗体的先决条件，所得到的抗体又可反过来纯化和检测抗原。

(一)抗原的制备抗原种类繁多，按其物理性状可分颗粒性和可溶性两类。

前者指细胞性抗原(包括细菌抗原)，其制备较为简便，一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤后配成一定浓度。

若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处理，H抗原因不耐热用0.3％～0.5％甲醛处理，O抗原耐热可加热100℃2h去除H抗原后应用。

可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中的一些可溶性因子。

细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀或层析等方法进一步纯化。

而体液中(如血清等)的可溶性抗原则可直接用生化手段获得所需成分。

有些可溶性抗原仅具有免疫反应性，而无免疫原性，此类抗原尚需与载体偶联方可成为完全抗原。

(二)抗体的制备单克隆抗体和多克隆抗体：单克隆抗体(McAb)用杂交瘤技术制备(详见第三章)，其特点：特异性好，亲和力高，只识别一个表位。

多克隆抗体(polyclonal antibodies)存在于免疫动物的血清中，可通过直接分离血清获得，主要应用于免疫学诊断。

也可经中性盐析和层析法进一步提出单一类别的免疫球蛋白(多为IgG)，使诊断及各种研究在更精确的水平上进行。

优点：可识别多个表位，缺点：特异性差，易出现交叉反应，亲和力低，通过其他抗原的吸收可获得针对单个抗原决定簇的单价因子血清。

嵌合抗体和噬菌体抗体等基因工程抗体制备详见第三章。

四、血清学反应的种类抗原抗体反应种类甚多，为叙述方便按反应现象分类介绍于下。

(一)凝集反应(agglutination)指颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原(亦可用抗体)吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒(免疫微球)与相应的抗体(或抗原)，在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。

1.直接凝集反应(direct agglutination) 是颗粒性抗原又称凝集原与相应抗体直接结合所呈现的凝集现象，如红细胞和细菌凝集试验。

主要有玻片法、试管法及微量凝集法。

玻片法为定性试验，方法简便快速，常用已知抗体检测未知抗原，应用于菌种鉴定，分型及人红细胞ABO血型测定等；试管法通常为半定量试验，常用已知抗原检测待检血清中有无相应抗体及其相对含量，以帮助临床诊断和分析病情。

例如临床实验室常用的诊断伤寒或副伤寒的肥达氏试验(Widal test)；诊断布鲁氏菌病的瑞特氏实验(Wrig test)及诊断斑疹伤寒及恙虫病的外裴二氏试验(Weil felix test)等。

2.间接凝集反应(indirect passive agglutination) 是可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的微球载体上，形成致敏载体(免疫微球)，与相应的抗体或抗原在电解质存在的条件下进行反应，产生凝集，称为间接凝集或被动凝集；实验室常用的载体微球有人O型血红细胞、绵羊或家兔红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等，根据应用的载体种类不同，分别称为间接血凝、间接乳胶凝集及间接炭凝试验等。

本试验主要用于某些传染病如钩端螺旋体抗原和原发性肝癌的早期诊断。

间接凝集反应扩大了凝集反应的应用范围，其发展取决于载体，修饰载体使其带有化学活性基团，或选用吸附力强、稳定性高和带有色素的载体，必将演化出新的方法。

3.间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test) 将可溶性抗原与相应抗体预先混合并充分作用后，再加入抗原致敏的载体，此时因抗体已被可溶性抗原结合，阻断了抗体与致敏载体上的抗原结合，不再出现凝集现象，称为间接凝集抑制试验。

临床常用的免疫妊娠试验(immune pregnancy test)即属此类。

若以红细胞作为载体则称为间接血凝抑制试验。

所有上述凝集试验均可划分为正向和反向凝集试验，以已知抗原测抗体的凝集试验为正向凝集试验，通常“正向”两字省略，反之，为反向凝集试验。

4.协同凝集试验(co-agglutination) 以金黄色葡萄球菌为载体，利用其细胞壁中的A蛋白(SPA)具有结合人及多种哺乳动物IgG Fc段的特性。

将特异性抗体结合至金黄色葡萄球菌菌体，其Fab段暴露于菌体表面，遇到相应抗原时与之结合，即可导致金黄色葡萄球菌凝集(图18.2)。

称为协同凝集试验。

常用于早期诊断流脑、伤寒、菌痢及布鲁氏菌病。

5.抗人球蛋白试验(anti-human globulin reaction) 机体受抗原刺激后，除可产生完全抗体外，在某些病人(先天性溶血性贫血)也可产生不完全抗体(IgG)，后者虽能与抗原结合，但不出现肉眼可见反应现象。

Coomb等把含有不完全抗体血清球蛋白注射到异种动物体内，使其产生抗人球蛋白抗体，将该抗人球蛋白抗体加入到颗粒性抗原与相应的不完全抗体复合物中，就能出现肉眼可见的凝集现象，称为抗人球蛋白试验，又称Coomb's试验。

主要用于检测Rh抗体及布鲁氏菌抗体。

图18.2 凝集试验示意图(二)沉淀反应(precipitation)可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。

参与反应的抗原称沉淀原(precipitinogen)，抗体称沉淀素(precipitin)。

沉淀原可以是多糖、蛋白质、类脂等，由于其体积小，相对反应面积大，故试验时需对抗原进行稀释，以避免后带现象。

应用较早的沉淀反应是环状沉淀反应(ring precipitaion)和絮状沉淀反应(flocculation precipitation)，因其敏感性不高，已被淘汰。

目前应用最多的沉淀反应是Oudin建立的凝胶(琼脂)沉淀反应及其派生方法。

1.单向琼脂扩散(simple agar diffusion) 简称单扩，将特异性抗体与熔化的琼脂混合均匀，使抗体均匀分布于琼脂，然后浇制成琼脂板，再按一定要求打孔并加入抗原，使抗原向孔周自由扩散，与板中的抗体形成沉淀圈。

本法为定量试验，沉淀圈的直径与抗原浓度成正比。

单扩常用于血清中免疫球蛋白、AFP等的定量测定。

2.火箭电泳(rocket electrophoresis) 若在单向琼脂扩散基础上，加入抗原后，将琼脂板置电场中，使抗原置于负极即向正极定向扩散，在与板中的抗体结合而形成锥形沉淀峰，形似火箭，故名火箭电泳。

沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。

由于在电场作用下，促使带负电荷多的抗原泳动，故火箭电泳需时短，可用于快速测定抗原含量，如在标本中加入少量同位素标记的抗原后，可作放射免疫自显影，能检出微量抗原。

应用范围与单扩相似。

3.双向琼脂扩散(double agar diffusion) 简称双扩，先制备琼脂板，再按要求打孔并分别加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂板上扩散，若两者对应且比例合适，则在抗原和抗体两孔之间形成白色沉淀线。