➢ （3）平板培养法：单细胞接种于固体培养基
上，获得单细胞形成的细胞系
➢ （4）条件培养法：接种于条件培养基上形成
的细胞系。条件培养基指培养过细胞的培养基 上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固 体培养基。
2.单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单 倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株
➢ 一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象 ➢ 用花粉在固体培养基上培养
(3)丹参发根生物反应器大规模培养技术
➢ 丹参(Salvia miltiorrhiza) ：活血化淤,通经止痛. ➢ 丹参中含有二类活性成分: 脂溶性二萜醌类化合物和水溶性
酚酸类化合物.具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉 供血等药理作用,是治疗心血管系统疾病的重要药物。 ➢ 丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长, 加之近年 产地环境污染和为防病虫喷施农药等原因, 便得原料药的供 应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。
➢ 植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织
培养主要用于形成组织和再生成植株
➢ 细胞培养主要生成次生代谢产物 ➢ 基本技术：
✓植物材料的准备 ✓培养基制备 ✓培养方法的选择
植物组织培养
1.理论基础 细胞的全能性
2.：基本原理：外植体脱分化愈伤组织再分化 胚状体
试管苗
（丛芽）
脱分化
再分化
外植体
愈伤ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ织
2 植物细胞的生物学特性
➢ 细胞的全能性: 一个细胞所具有的产生完整生物个体的固
有能力。 具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有
发育成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的 全能性。
细胞为什么会具有全能性呢？
生物体的每一个细胞追根溯源都是受精卵分裂、分化 而来的，含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育 成为完整个体所必需的全部基因。
➢ 紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又作为 高级色素使用。
➢ 紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足 市场需求。
➢ 化学合成紫草宁的工艺非常复杂， 且最终产率只有0.7％，生产成本昂贵。
➢ 紫草宁在国际市场上售价高达7000美元/kg
➢ 1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。 ➢ 1981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬
➢ 代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或
相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具 有遗传稳定性。
➢ 毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别
适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较 高含量的次级代谢产物。
➢ 毛状根具有如下特点：
✓ 激素自养，不必加外源激素； ✓ 次级代谢产物含量高且稳定； ✓ 增殖速度快。
大田栽培的方式取而代之。免疫途径也将采用直接食用或 加工后口服植物(果实)，即出现可食性疫苗(edible vaccine)和口服疫苗(oral vaccine)
➢ 优点：
✓ 1易形成产业化规模；2价格便宜；3安全；4使用方便 ✓ 5.植物具有完整的真核细胞表达系统。表达产物可糖基
化、酰胺化、磷酸化及可完成对亚基的正确装配等翻 译后加工过程，使表达产物具有与高等动物细胞一致 的免疫原性
试管苗
植物体
3.1 植物细胞的获得和扩大培养
（一）植物细胞的获得
➢ 1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物
外植体中分离
➢ 2.愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细
胞悬液
➢ 3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体
或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原 生质体细胞壁再生获得植物细胞
合细胞生长的培养基，营养丰富)，第二个用于次级代谢 产物的生产(较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的 糖分或少量的碳源)
➢ 日本科学家用此方法开发了第一个植物细胞工程产品——
紫草宁
➢ 通过提高第二个反应器中的Ca2+浓度，大幅度增加了 培养液中的紫草素含量
4.2 生产抗体、重组疫苗、多肽类药物
➢ 上游生产成本低 ➢ 获取的遗传性质稳定 ➢ 自然条件下易于生长，管理 ➢ 植物作为生物反应器，可省去下游提取，廉价
有耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力，
➢ 而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病
毒病原体的污染问题。
1.2 植物细胞的药用成分
➢ 市售中成药的25%来源于植物提取药物或半合
成药物
➢ 一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包
括生物碱、挥发油和有机酸。
➢ 一类为生理活性物质，如酶、维生素、植物激
素、植物杀菌素等
➢紫杉醇(Paclitaxel):二萜类化合物, 抗癌药，是有
丝分裂抑制剂，可阻止微管正常生理聚集，抑制 癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细 胞的复制受到阻断而凋亡。
➢ 1967年美国化学家Wall和Wani首先从太平洋紫
杉（短叶红豆杉）树皮中提取出来。该药1992年 底获美国FDA批准上市。
➢ 用发根农杆菌经直接注射法，外植体接种感染，
原生质体共培养法诱导毛状根
➢ 发根农杆菌转化后，经筛选鉴定 ➢ 低盐浓度下生长，培养
3.2 植物细胞培养工业化存在的问题
➢ 生长缓慢,通常完成一次生产周期需4-5周 ➢ 次级代谢物含量低 ➢ 培养细胞不稳定等 ➢ 多数产物积累于胞内 ➢ 不耐受剪切力 ➢ 一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于1000美元
（二）植物细胞的培养方法
1.单细胞的培养
➢ （1）看护培养法（nurse
culture）：在单细胞的生长
环境里加入愈伤组织同时培 养。愈伤组织提供促细胞分 裂的物质等，传递生物信息 ，使持续分裂增值等。
➢ 即愈伤组织看护单细胞
➢ （2）微室培养法：单细胞接种到小室里，密
封培养，观测单细胞的生长发育情况
的糖基化更具有异质性，不同植物产生的糖基化末端不相同，即 使是同一株植物不同时期产生的糖基末端仍有不同。糖基化不会 对抗体与抗原的结合能力及特异性产生影响 ，但可能会影响抗 体构型或体内的清除。
➢ 目前研究发现苜蓿可产生单一糖型的抗体，它有望成为更为合适
➢ 许多IgG单抗已能在植物中表达，且在治疗中有应用价值
。第一个在植物中表达的抗体是IgG1，通过杂交繁殖的 烟草表达其重链及轻链构成完整的抗体，图5-13 。
➢ 目前，表达的类型有分泌抗体和抗体片段。分泌抗体，如
sIgA-G植物抗体，在美国已经运用于临床试验。
➢ 多数在E．coli中能表达的抗体片段在转基因植物中也被
成功表达。这包括烟草中表达的单个结构域抗体、单链抗 体分子。
➢ 其中scFV是目前为止转基因植物中表达最为广泛的抗体
片段。
(2)利用转基因植物生产疫苗
➢ 自92年，HBsAg基因转入烟草中表达。已取得了巨大发
展，已成功地在水果、蔬菜、粮食作物中表达了人类或动 物的病原体抗原蛋白，并进行I／Ⅱ期临床试验，取得了一 定效果。
➢ 转基因植物将打破传统的疫苗或功能蛋白的生产方式，以
等。
(3)利用转基因植物生产其他药物
➢ 人体内含有甚微但具有重要临床价值的蛋白或
➢ 不足之处：
✓ 转基因植物中重组蛋白含量低 ✓ 植物外源蛋白的提取和纯化还没有达到产业化水平，
还停留在实验室水平。
➢ 目前的转基因植物疫苗离临床还很远，限制因素
，包括：
➢ 表达量偏低(从现有的研究中，外源基因所表达的
重组蛋白大约只占植物中总可溶性蛋白的0.01%0.37%
➢ 免疫效果较差，口服免疫可能引起口服免疫耐受
浮培养并获得了紫草宁衍生物。
➢ 日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。 ➢ 我国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进
行大量的研究之后得出，在适当的条件下，培养的紫草 细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中的 含量高10倍。
➢ 使用两个生物反应器，第一个用于细胞生物量的累积(适
细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件 下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化 ，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态 ，转变为具分生能力的胚性细胞。
已分化的细胞要表现全能性，首先要脱分化形 成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株
脱分化条件：创伤和外源激素。
3 植物细胞的培养
生物制药工程认知 4 植物细胞工程制药
1
1 概述
➢ (1)在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和
组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得 有药用价值的次生代谢产物。
➢ (2)采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞
的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植
物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。
➢ 用植物组织培养反应器(10L规模)进行了丹参发根培
养的研究, 发现丹参发根在50天内鲜重增殖倍数可高 达240倍左右,丹参酮、丹酚酸A的含量也相当高，非 常适合于丹参发根的生长及丹参酮的积累,而且利用 此系统生产出的丹参及其有效成分由于不受农药等污 染物的影响,具有广阔的市场前景。
➢ 丹参发根生物反应器培养的中试已达100L规模。
在生物体内，细胞为什么没 表现出全能性，而是分化为 不同的组织、器官呢？
这是因为在特定的时间和空间条件下选择 性表达的结果。在个体发育的不同时期， 生物体不同部位的细胞表达的基因是不相 同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成 了不同的组织和器官。
2.1 植物细胞什么条件下才能表现出全能性呢？
当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织 而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其它 外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完 整的植株。
1.1利用组织和细胞培养技术生产药用成分
➢ 植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物