二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称 为间隔臂），然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被淋洗出；随后 ，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输 液泵是核心部件。
（1）贮液器 用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
（2）过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9－3中。
图9－3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定，采用液－固色谱法。
色谱条件：50cm×2.5mm（内径）色谱柱；
三、HPLC法应用实例
流动相：正己烷； 固定相：薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m）；
流速：1.5ml/min
检测器：示差折光
色谱图：如图9－4 。
图9－4 有机氯农药的HPLC分析 1. 艾氏剂；2. p，p’－DDT； 3. p，p’－DDD；
敏度高、重复性好、定量精度高、操作自动化、应用范围广等
优点。适用于分析高沸点、强极性、热稳定性差的化合物。缺
点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子 和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
二、方法原理
现在的色谱法已不局限于色素的分离，其方法也已经得到了 极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的:利用欲分离的诸组 分在固定相和流动相间的分配有差异（即有不同的分配系数） ，当两相作相对运动时，这些组分在此两相中的分配反复进行 ，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随 着液体流动相移动却可以有明显的差距，最后使这些组分都得 到分离。
二、主要部件及功能
3.分离系统 分离系统包括色谱柱、柱温箱及连接管等。 色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件，色谱柱由柱管和固定
相组成。色谱柱分为分析型和制备型两类。 4.检测系统 关键部件是检测器。检测器的作用是将柱流出物
中样品组成和含量的变化转变为可供检测的信号。高效液相 色谱仪按其应用范围可分为通用型和专用型两大类。
一、色谱法简介
色谱法是1903年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett） 应用吸附原理分离植物色素的方法。
高效液相色谱法（HPLC)是20世纪70年代讯速发展起来的
一项高效、快速的分离技术。他是在经典的液体柱色谱的基础
上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采用了高压泵、高效
固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率和灵
2. 全多孔型固定相
二、固定相和流动相的选择
3．固定相的选择
（1）要求固定相粒度（dp）小、筛分范围窄、填充
均匀，以减小涡流扩散和动态流动相传质阻力。 （2）选用浅孔道的表面多孔型载体或粒度小的全多孔
型载体，以减少静态流动相传质阻力和固定相的传质 阻力。
二、固定相和流动相的选择
（二）流动相 1.对流动相的要求 （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好
第九章 高效液相色谱法
§1-1 概述 §1-1 高效液相色谱仪 §1-1 高效液相色谱法的应用
本章学习目标
【知识目标】
掌握高效液相色谱仪的工作流程； 熟悉高效液相色谱的固定相和流动相及高效液相色谱法的点； 了解液相色谱的分离原理和液相色谱的基本类型。
【能力目标】
学会高压泵和梯度洗脱技术； 能够操作高效液相色谱仪。
的选择性。 （2）溶剂与检测器匹配。 （3）高纯度。 （4）化学稳定性好。 （5）低粘度 2．对流动相的选择
三、HPLC法应用实例
高效液相色谱法适宜于分离、分析高沸点、热稳
定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因
而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物
、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀 虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。
二、主要部件及功能
通用型检测器，又称总体性质检测器，其响应值取决于 流出物（包括试样和流动相）总的物理或物理化学性质 的变化。
专用型检测器，又称溶质性质检测器，其响应值取决于 流动相中被分离组分的物理或物理化学性质。
5.数据处理系统 HPLC通常配备有记录仪、积分仪或色 谱工作站等，以完成对检测信号的记录、处理和控制等 。
二、主要部件及功能
2.进样系统 是将样品溶液导入色谱柱的装置。在高效液相色谱法 中，对进样装置的要求是具有良好的密封性和重复性，死体积小。 常用的进样方式有注射器进样和六通阀进样两种。目前普遍采用是
六通阀进样。如图9-2所示。
泵 泵
柱 柱
排放 进样
排放 进样
图9-2 六通阀采样和进样示意图
一、组成与结构
高效液相色谱仪
的结构主要由高压输
液系统、进样系统、
分离系统和检测系统
四部分组成。此外，
还配有辅助装置如梯
度淋洗，自动进样及
数据处理等。
工作流程如结构示意 图9-1：
贮液瓶
脱气装置
高压泵 梯度装置
流量控制
控温
进样装置
记录器
数据处理
检测器
分离柱
废液
图9－1 高效液相色谱仪的结构示意图
二、主要部件及功能
二、主要部件及功能
（3）高压输液泵 一个好的高压输液泵应符合下列要求：① 密封性好，耐腐
蚀；② 有足够的输出压力，使流动相能顺利通过色谱柱；③ 输出压力平稳，脉冲小；④ 输出流量恒定，可调范围宽；⑤ 泵室体积小（＜0.5 mL），易于清洗，便于迅速更换溶剂。 （4）梯度洗脱装置 利用两种或两种以上的溶剂，按照一定的 时间程序连续或阶段地改变溶剂的比例，从而改变流动相的极 性、离子强度或pH值等，从而提高试样的分离效率，缩短分析 时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确 度。
4. γ－666；5. 恩氏剂。
能力）的差别来实现分离的。
二、方法原理
3. 离子色谱法 离子色谱（IC）是20世纪70年代发展的新 方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各 种离子用电导检测器检测。
4.分子排阻色谱法（又称凝胶色谱） 主要用于大分子的分子 分离。
原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但 孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物 不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分 法原理
1.分配色谱法 是利用待测物在互不相溶的两相中分离系数 的不同使组分分离的一种方法。其中一相被涂布或健合在固 体载体上（固定相），另一相为液体或气体（流动相）。
正相色谱 反相色谱 2.离子交换色谱法 是利用离子交换原理和液相色谱技术相
结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换