不符合基因工程的安全要求。带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因， 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
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（2）Col质粒：
带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。 大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因， 也可以成为接合型质粒。
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质粒的复制类型
1. 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1—3份拷贝。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
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外源基因BamH I Amp中存活
但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活
但在Amp中死亡
?
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② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、 pUC11、pUC18、pUC19
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（1）元件来源 ① 复制起点: pBR322的 ori ② Ampr 基因: pBR322的Ampr基因 ③ lacZ的启动子: 来自于大肠杆菌 ④ lacZ’基因: 大肠杆菌LacZ的-肽链 序列， 是LacZ 的氨基端片断。
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② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
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（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
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2. 质粒的类型
（1）元件来源
① 复制起点 ori：pMB1系列（来源于 ColE1）的高拷贝型复制起点 ② Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因 ③ Tetr基因： pSC101的Tet r 基因。
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（2）长度 4363bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点 24个克隆位点。
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② 改造EcoR I 位点 pBR325： 使EcoRI 也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌 体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉 素抗性基因cmlr）。
cmlr上也带一个EcoRI位点。
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2. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改 造而成。属正选择载体。
3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
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4. 基因工程载体的必备条件
（1）复制子，在宿主细胞内能独立复制； （2）有选择性标记，有一个或多个鉴于检测的遗传
标记； （3）有一段多克隆位点。位于非必需区内的DNA序
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型DNA polymerase III ）。
2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型 DNA polymerase I ）。
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5.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略
（1）去掉非必需的DNA区，保留质粒必需区， 降低分子量；
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）；
3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
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4363bp
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（5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
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大肠杆菌的质粒
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5.1.1 质粒的一般生物学特性
（1）分子小： 1—200 kb
（2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。 （3）环形状： 双链环状DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。 5-5
（4）质粒的空间构型： ① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移 非接合型质粒:不能自我转移
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1. 接合型质粒：
又叫自我转移型质粒。 除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
④ 安全
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。 不能通过接合转移。
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（6）pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
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（7）pBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153： 从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
列内含有多个单一的酶切位点；外源DNA插入其 中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。具有较高的遗传稳定性； （5）容易从宿主细胞中分离纯化。
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5.1 质粒载体
质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链 闭合环状DNA分子。一般为1-200kb。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
（2）减少质粒本身内切酶位点的数目；
（3）加入易检出的筛选标记；
（4）关于质粒安全性的改造，不发生重组和转 移，不能离体扩增；
（5）改造或增加表达基因的调控序列；如启动 子、增强子等。
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5.1.3 质粒克隆载体的构建
1. pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。