蛋白翻译后加工系统；
不含有特异性的病毒、不产内毒素； 酵母菌是最简单的真核模式生物。
酵母菌的结构
酵母菌中的野生型质粒 酿酒酵母中的2m环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 REP FL
环状质粒，拷贝数达50至100个。
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 RA F STB A
1 原理
在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其 包进半透性的多聚物膜内。小分子的底物和产物均可 自由出入，而菌体细胞却不会漏出。
2 方法
常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂 以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例
将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸 胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合 。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.5 ％
第三节 基因工程菌的不稳定性

一、质粒的不稳定性
1 质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不
稳定 2 质粒的不稳定性产生的原因
（1）工程菌的质粒由于分裂的原因而不稳定；
造成质粒的丢失； 两种菌的比生长速率有差异。 （2）工程菌质粒结构的不稳定是由于DNA从 质粒上丢失、重排、缺失导致工程均性能的改 变。
几种常见的表达系统
大肠杆菌

原核表达系统
枯草杆菌 酵母

真核表达系统
哺乳动物细胞 昆虫细胞 植物细胞
（一） 原核细胞表达体系

大肠杆菌：最常用的表达形式。

大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
将细胞的生长和外源基因的表达分为两个阶段； 将细胞的生长与质粒的表达分开；
蛋白质以包涵体形式存在。
E 工程菌的培养条件
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28℃时，每个 细胞的质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数迅速增至300 – 600。
2 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 ① 以融合蛋白的形式表达药物基因
种子培养
发酵培养
基因工程菌的培养设备

发酵罐
第四节 基因工程药物的分离纯化
生物技术产品一般是活性肽或蛋白质，它们 具有如下特点：
①初始物料中含量低； ②基体组成复杂； ③稳定性差； ④种类多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂 的有机化合物，以及结构复杂而又性质各异的生物 活性物质； ⑤应用面广，要求质量、纯度高，无菌无热源等。
细菌启动子 SD序列 AUG 结构基因
终止密码

③以分泌型表达蛋白药物的基因
外源基因的表达产物在胞质内合成，后被运输至
细胞周质，信号肽被信号肽酶识别、切割。
避免被细菌蛋白酶降解； 产物不含有甲硫氨酸； 产量不高；
信号肽不切割或切割位置不正确。
外源基因的结构
细菌启动子 SD序列 AUG 信号肽 结构基因
生产6－APA 生产半合成青霉素
二 载体结合法（吸附法）
1 原理
微生物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以 与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。
2 常用载体
离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAE－纤维素。
3 优缺点
优点：方法简单、载体易于再生。 缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。
载体结合法制备固定化菌体举例 载体 离子交换纤维素 菌体 丝状菌孢子 转化酶 酶 用途 蔗糖的转化

三 细胞的破碎方法

外力使用与否：机械法，非机械法 属性：物理法、化学法、生物法
匀浆法
物理法
珠磨法
（二） 真核细胞表达体系
酵母：最有效的单细胞真核微生物。 常用啤酒酵母。 动物（哺乳动物和昆虫） 植物细胞


酵母表达外源基因的特点：
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简
便；
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉； 成功建立了几种有分泌能力的表达系统； 表达产物可以进行糖基化；具有原核细菌无法比拟的真核
表达产物的运输
（2）分泌信号的效率：
表达产物的修饰
信号肽+前导肽
（3）终止序列的影响： 终止序列保证了转录产物（mRNA）在适当部位终止，并加上 polyA尾巴。
常用的终止子有：ADH1,
CYC1, MF∝1，PGK。
3 外源蛋白的糖基化


外源蛋白在酵母细胞中存在两种糖基化形式： N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键（丝 氨酸或苏氨酸连接），与天然状态下相同。 酵母细胞能够识别这两种糖基化信号，使外 源蛋白正确折叠，产生与天然状态相同的蛋 白，分泌到胞外。
状质粒成分。拷贝数可高达100-200。 （2）YRp类：非2m-来源的自主复制序列 （ARS）。拷贝数5-10。 （3）YCp类：非2m-来源的自主复制序列 （ARS）。含酵母染色体中心粒成分，拷贝数1。
（4）YIp类：含有可与酵母染色体重组的序 列，整合到酵母染色体中，随酵母染色体一 起复制，稳定性好。拷贝数1 。
八、目的基因在受体细胞中的表达
基因表达：结构基因在生物体内的转录、翻 译以及所有加工过程。 基因工程中基因的高效表达：外源基因在生 物体内的转录、翻译以及所有加工过程

真核基因在原核细胞中表达的困难
1. 2. 3.
细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子 mRNA的SD序列不能与核糖体结合 真核蛋白易被细菌蛋白酶破坏
固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的酶不经过分 离提纯 直接用适当的方法将菌体加以固定来催化各种特定 的生物化学反应。 优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成
本低——与固定化酶比较
制备方法：与固定化酶相同，有包埋法、载 体结合法、交联法、热处理法、射线处理法 。 其中包埋法是最理想的方法。
一 包埋法
包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 琼脂
菌种 大肠杆菌 大肠杆菌
短乳杆菌 链霉菌 大肠杆菌 大肠杆菌
酶系 谷氨酸脱羧酶 青霉素酰胺酶
葡萄糖异构酶 天门冬氨酸酶 青霉素酰胺酶 （裂解） 青霉素酰胺酶 （合成）
用途 制造γ-酪蛋白 生产6-氨基青霉烷酸(6APA)
从葡萄糖生产高果糖浆
明胶－戊二醛 聚丙烯酰胺 醋酸纤维素
2 克隆载体

质粒转化酵母通常有两种方式：
碱金属离子（Li)介导的酵母菌完整细胞的转化 酵母菌电击转化法

鉴于从大肠杆菌转化和制备质粒比酵母容易的多，
可向酵母载体中引入大肠杆菌的起始和抗生素筛选 标记，此类克隆载体即可以在细菌中，又可以在酵 母中进行质粒复制和表型选择。
3 表达载体

啤酒酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统

6 固定化： 固定化载体有海藻酸胶、卡拉胶、明胶、甲壳素等。 固定化培养大肠杆菌W3110（pTG201）240代没有测到 质粒丢失。
固定化方法 酶的固定化方法有下述4种：吸附法，包埋法，共价键结 合法，交联法
E E E
E E E E
E E E
E E E
E
E
E
E
E
吸附法
E
共价结合法 交联法 包埋法
1
I
R or I i R
P
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
同源重 组
Hale Waihona Puke REP 2B粒类似。
1 载体的分类：根据载体的复制序列分为 四类： （1）YEp类：复制序列为酵母天然的2m-双链环
胞外产物
浓缩
初步分离
高度纯化
制 剂 产 品
基因工程药物分离纯化的一般流程
分离纯化要求：条件温和、选择性好收率 高、两个技术之间能直接衔接以及整个过 程要快，能满足高生产率的要求。 1、细胞破碎与固液分离： 收集—破碎—固液分离：离心、萃取、膜 技术等 2、目的产物的分离纯化：色谱方法 3、非蛋白质类杂质的去除：主要是DNA、 热原质和病毒。
一、建立分离纯化工艺的根据

1、含目的产物的起始物料的特点
2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量要求

二、分离纯化的基本过程

一般包括如下几个方面的过程：细胞破碎、 固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至 得到纯品以及成品加工。
发酵液
细胞分离
胞内产物
细胞破碎 固液分离 包含体 变性 复性 细胞碎片分离
C. 表达产物的稳定性
① ② ③ ④ 组建融合基因； 利用内源或外源信号肽将产物运送到胞间浆周质； 改变真核蛋白质二级结构； 采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌。Ion-营养缺陷型大肠杆 菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。
D 细胞的代谢负荷
外源基因的表达产物可能本身对宿主菌有毒性，或因消
耗其氨基酸等营养物质对宿主菌产生间接毒害。 解决方案：
引起免疫反应；
细胞周质内含有种类繁多的内毒素。
1、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
A. 外源基因的剂量 B. 外源基因的表达效率
① 启动子的强弱：容易被RNA聚合酶识别并能够稳定 结合； ② 核糖体结合位点的有效性；消除相关二级结构。 ③ SD序列和起始密码的间距； ④ 密码子组成；选择大肠杆菌偏爱的密码子。
阴离子树脂
DEAE-纤维素
放线菌
巨大芽孢杆菌
葡萄糖异构酶
青霉素酰胺酶
制造果糖
制造6APA
基因工程制药上游技术